Теперішній час†Поточна адреса: OX11 0DE, Велика Британія, будівля Diamond, науково-інноваційний парк Harwell, Діеткот, Оксфордшир, Велика Британія, Diamond Light Source Co., Ltd., Центр електронної біологічної візуалізації.
Світлозбиральний комплекс реакційного центру 1 (RC-LH1) є основним фотосинтетичним компонентом пурпурових фототрофних бактерій. Ми представили дві кріоелектронно-мікроскопічні структури комплексу RC-LH1 з Rhodopseudomonas palustris. Структура комплексу RC-LH114-W з роздільною здатністю 2,65 Å складається з 14 субодиниць петель LH1, що оточують RC, яка переривається білком W, тоді як комплекс без білка W повністю має RC-композицію, оточену RC. Закрита петля LH1 з 16 субодиниць. Порівняння цих структур дає уявлення про динаміку хінону в комплексі RC-LH1, включаючи раніше невизначені конформаційні зміни при зв'язуванні хінону в сайті QB RC, а також розташування допоміжних сайтів зв'язування хінону, які допомагають передавати їх до RC. Унікальна структура білка W запобігає закриттю петлі LH1, тим самим створюючи канал для прискорення обміну хінон/хінолон.
Енергія, що забезпечується фотосинтезом, може підтримувати майже все життя на Землі, і вона має великий потенціал для сонячної біотехнології. Сприяючи глобальному фотосинтезу, пурпурні фототрофні бактерії також демонструють різні енергетичні режими та метаболічні можливості. Вони можуть уникати фотосинтезу та рости як гетеротрофні бактерії в темряві, можуть фіксувати азот і вуглекислий газ, виробляти водень і розкладати ароматичні сполуки (1-3). Щоб забезпечити енергію для цих процесів, світло має бути швидко та ефективно перетворене на хімічну енергію. Цей процес починається, коли світлозбиральний антенний комплекс поглинає світло та передає захоплену енергію до реакційного центру (RC), тим самим запускаючи розділення зарядів (4-7). Основна одиниця фотосинтезу у пурпурних фототрофних бактерій складається з RC 2 типу, оточеного світлозбиральним комплексом 1 (LH1), що утворює основний комплекс RC-LH1. LH1 утворений масивом вигнутих αβ гетеродимерів, кожен з яких зв'язує дві молекули бактеріального хлорофілу (BChl) a та один або два каротиноїди (8-12). Найпростіша антена LH1 складається з 16 або 17 αβ гетеродимерів, що оточують RC (9-13) у замкнутому циклі, але в інших основних комплексах трансмембранні пептиди переривають безперервність навколишнього LH1, тим самим сприяючи дифузії хінолу/хінону між RC та комплексом цитохрому bc1 (11, 13-15). Фіолетова фототрофна рослина Rhodopseudomonas (Rps.) є модельним організмом, який може розуміти перенос енергії та електронів, що підтримує фотосинтез. Перша кристалічна структура Rps. Модель комплексу RC-LH1 болотного - RC, оточений 15 гетеродимерними петлями LH1, які перериваються невідомим білком під назвою «Protein W» (14). Protein-W згодом був ідентифікований як RPA4402, який є неохарактеризованим білком 10,5 кДа з трьома передбачуваними трансмембранними спіралями (TMH) (16). Ми пропонуємо перейменувати ген rpa4402, що кодує білок W, на pufW, щоб відповідати номенклатурі, яка використовується для генів, що кодують субодиниці RC-L, M (pufL, pufM) та LH1α, β (pufA, pufB). Цікаво, що білок W присутній лише приблизно в 10% RC-LH1, що свідчить про те, що Rps. palustris продукує два різні комплекси RC-LH1. Тут ми повідомляємо про кріо-ЕМ (кріо-ЕМ) структури високої роздільної здатності двох основних комплексів, один з білком W та 14 αβ гетеродимерами, інший без білка W та із замкнутою петлею LH1 з 16 гетеродимерів. Наша структура являє собою крок у зміні в розумінні комплексу RC-LH1 Rps. palustris, оскільки ми проаналізували однорідну популяцію кожного варіанту та маємо достатню роздільну здатність, щоб чітко визначити кожен пептид та зв'язані пігменти, а також пов'язані ліпіди та хінони. Порівняння цих структур показує, що три білки TMH-W, які досі не були виявлені в жодному іншому комплексі RC-LH1, генерують хіноновий канал для прискорення обміну хінон/хінолон. Було ідентифіковано низку консервативних сайтів зв'язування ліпідів та хінонів, і ми виявили нову конформаційну зміну після комбінації хінону та RC, яка може бути придатною для RC фотосистеми II (PSII) оксигенованих фототрофних організмів. Наші результати дають нове розуміння кінетики зв'язування та обміну хінон/хінолонів у основному комплексі RC-LH1 пурпурових фототрофних бактерій.
Для полегшення детального вивчення двох комплексів, знайдених у Rps. palustris, ми виділяємо кожен RC-LH1 біохімічними методами. Комплекс з дефіцитом білка W (далі - ΔpufW) був очищений зі штаму, якому бракує гена pufW (16), і може бути отриманий лише один комплекс RC-LH1. Комплекс, що містить білок W, продукується штамом. Білок W цього штаму модифікований 10-кратною міткою His на своєму C-кінці, так що комплекс, що містить білок W, може бути ефективно поєднаний з білком W, якому найбільше бракує, шляхом іммобілізації металу. Комплекс ефективно розділяється (16) за допомогою афінної хроматографії (IMAC).
Як показано на рисунку 1, обидва комплекси містять три субодиниці RC (RC-L, RC-M та RC-H), оточені антеною LH1. Структура 2,80 Å комплексу, в якому відсутній білок-W, демонструє 16 αβ гетеродимерів, що утворюють замкнуту петлю LH1, що повністю оточує RC, далі — комплекс RC-LH116. Структура 2,65 Å комплексу, що містить білок-W, має 14-гетеродимер LH1, перерваний білком-W, далі — RC-LH114-W.
(A та B) Поверхневе зображення сполуки. (C та D) Зв'язані пігменти, експресовані паличками. (E та F) Комплекси, що спостерігаються з цитоплазматичної поверхні, мають пептиди та субодиниці LH1, зображені малюнками, та пронумеровані за годинниковою стрілкою від проміжку білок-W [відповідно до нумерації Rba. комплекс sphaeroides (13)]. Для LH1-α колір білкової субодиниці жовтий; для LH1-β колір білкової субодиниці синій; для білка-W білок червоний; для RC-H він блакитний; для RC-L він помаранчевий; для RC-M пурпуровий. Кофактори представлені паличками, зелений колір представляє молекули BChl та BPh a, фіолетовий колір представляє каротиноїди, а жовтий колір представляє молекули UQ10. (G та H) Збільшене зображення проміжку білок-W в еквівалентній області комплексу RC-LH114-W (G) та комплексу RC-LH116 (H). Кофактори відображаються у вигляді заповнення простору, хелатний хінон показано синім кольором. Проміжок білок-W виділено синьою пунктирною лінією на (G), а маленькі отвори, де хінон/хінолол дифундує по кільцю LH116, виділені чорною пунктирною лінією на (H).
На рисунку 1 (A та B) показано RC, оточений відкритими або закритими масивами гетеродимерів LH1αβ, кожен з яких зв'язує два BChl та один каротиноїд (рисунки 1, C та D). Попередні дослідження показали, що Rps є комплексом LH1. У біосинтетичному шляху ксантину спіруліни ці види містять змішані популяції каротиноїдів (17). Однак спіропіроксантин є домінуючим каротиноїдом, і його щільність є задовільною. Тому ми вирішили моделювати спіроксантин у всіх сайтах зв'язування LH1. Альфа- та бета-поліпептиди - це поодинокі TMH з короткими зовнішніми ділянками мембрани (рисунки 1, A, B, E та F). Хоча щільність 17 залишків на C-кінці не спостерігалася, альфа-поліпептид розщеплювався від Met1 до Ala46 в обох комплексах. β-поліпептид був відновлений від Gly4 до Tyr52 в RC-LH116 та від Ser5 до Tyr52 в RC-LH114-W. Не спостерігалося щільності 3 або 4 N-кінцевих або 13 C-кінцевих залишків (Рисунок S1). Мас-спектрометричний аналіз змішаного комплексу RC-LH1, отриманого зі штаму дикого типу, показав, що відсутня область була результатом гетерологічного розщеплення цих пептидів (Рисунок S1 та S2). Також спостерігалося N-кінцеве формулювання α-Met1 (f). Аналіз показав, що α-пептид складається із залишків від fMet1 до Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, а β-пептид складається із залишків від Ser2 до Ala53, що добре узгоджується з картою щільності низькотемпературної ЕМ.
Координація α-His29 та β-His36 робить BChls віч-на-віч; кожен αβ гетеродимер збирається зі своїми сусідами, утворюючи відкритий контур (RC-LH114-W) або закритий контур (RC-LH116) навколо RC-екситонно-зв'язаного пігментного масиву (Рис. 1, C та D). Порівняно зі смугою 877 нм RC-LH114-W, червоний зсув поглинання RC-LH116 при 880 нм становить 3 нм (Рис. 2A). Однак спектр кругового дихроїзму майже однаковий (Рис. 2B), що вказує на те, що, хоча існує чітка різниця між відкритими та закритими контурами, локальне оточення BChls дуже схоже. Червоний зсув поглинання може бути результатом зменшення теплового руху та підвищеної стабільності на закритому контурі (18, 19), зміни зв'язку пігменту, спричиненої закритим контуром (20, 21), або комбінації цих двох ефектів (11).
(A) Спектр поглинання в ультрафіолетовому/видимому/ближньому інфрачервоному діапазонах, піки якого позначені відповідними пігментами та нормалізовані відносно піку BPh при 775 нм. (B) Спектр кругового дихроїзму, нормалізований відносно поглинання BChl при 805 нм. (C та D) Вибрані ΔA-спектри зі спектрів поглинання з роздільною здатністю в часі комплексу RC-LH114-W (C) та комплексу RC-LH116 (D). Для кращої порівнянністі всі спектри нормалізовані відносно ∆A від −A при 0,2 пс. (E) Швидкість окислення цитохрому с2 після опромінення в присутності різних концентрацій UQ2 (див. Рисунок S8 для отримання необроблених даних). (F) У клітинах, вирощених під дією світла низької, середньої або високої інтенсивності (10, 30 або 300 мкМм-2 с-1 відповідно), субодиниці білка W та RC-L в очищеному комплексі та співвідношення розділених мембран. Визначте рівень білка за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS) та імуноферментного аналізу (див. Рисунок S9 для отримання вихідних даних). Визначте співвідношення відносно очищеного комплексу RC-LH114-W. Стехіометричне співвідношення RC-L до білка-W комплексу становить 1:1.
BChl у положенні 1 у деформованій петлі αβ14 RC-LH114-W (рис. 1, A, C та E) розташовані ближче до первинного донора RC (P) на 6,8 Å, ніж еквівалентні BChl у RC-LH116 (рис. 1, B, D та F, а також рис. S3); однак кінетика перехідного поглинання двох комплексів показує, що для RC-LH114-W та RC-LH116 константи часу передачі енергії збудження від LH1 до RC становлять 40 ± 4 та 44 ± 3 пс (рис. 2). , C та D, рис. S4 та таблиця S2). Також немає суттєвої різниці в електронному переносі всередині RC (рис. S5 та пов'язаний додатковий текст). Ми підозрюємо, що близька відповідність часу передачі енергії між LH1 та RC-P зумовлена ​​подібною відстанню, кутом та потенційною енергією більшості BChl у двох петлях LH1. Здається, що дослідження енергетичної картини LH1 для досягнення мінімальної відстані не швидше, ніж пряме перенесення енергії з неоптимальних ділянок до RC. Розімкнута петля LH1 в RC-LH114-W також може зазнавати незначного теплового руху за низьких температур для структурного аналізу, і при кімнатній температурі спостерігається довша конформація кільця αβ14 від відстані пігментації βBChls у положенні RC1.
Комплекс RC-LH116 містить 32 BChl та 16 каротиноїдів, а його загальна структура така ж, як і отримана з Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Банк даних білків (PDB) ID 5Y5S] (9), штаму Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) та зелених водоростей (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Після вирівнювання спостерігалися лише невеликі відхилення в положеннях αβ гетеродимерів, особливо 1-5, 15 та 16 (Рисунок S6). Присутність білка-W має значний вплив на структуру LH1. Його три TMH з'єднані короткими петлями, з N-кінцем на стороні просвіту комплексу та C-кінцем на цитоплазматичній стороні (Рисунки 1A та 3, A-D). Білок-W значною мірою гідрофобний (Рисунок 3B), а TMH2 та TMH3 взаємодіють з LH1αβ-14, утворюючи трансмембранну поверхню (Рисунок 3, B та E-G). Інтерфейс в основному складається із залишків Phe, Leu та Val у трансмембранній області. Ці залишки укладені з гідрофобними амінокислотами та пігментами αβ-14. Деякі полярні залишки також сприяють взаємодії, включаючи водневий зв'язок між W-Thr68 та β-Trp42 на поверхні порожнини комплексу (Рисунок 3, F та G). На поверхні цитоплазми Gln34 прилягає до кетогрупи каротиноїдів αβ-14. Крім того, молекула n-додецилβ-d-мальтозиду (β-DDM) була розділена, а її гідрофобний хвіст поширився до межі між білком-W та αβ-14, а ліпідний хвіст може бути розташований в організмі. Ми також помітили, що C-кінцеві ділянки розділення білка W та RCH дуже близькі, але не входять до меж формування специфічних взаємодій (Рисунок 1, A та E). Однак, можуть бути взаємодії в нерозщеплених C-кінцевих амінокислотах цих двох білків, що може забезпечити механізм для рекрутування білка-W під час складання комплексу RC-LH114-W.
(A) Білок-W, який звернений до межі розділу з LH1αβ14 у мультяшному зображенні, має стрижнеподібний бічний ланцюг (червоний), що відображається в частині діаграми електростатичного потенціалу (прозора сіра поверхня з рівнем контуру 0,13). (B) Білок-W представлений гідрофобно забарвленою поверхнею. Полярні та заряджені області відображені блакитним кольором, гідрофобні області відображені білим, а сильно гідрофобні області відображені помаранчевим. (C та D) Білок-W, представлений у мультяшному зображенні, його орієнтація така ж, як у (A) (C), і повернутий на 180° (D). Відповідно до положення в послідовності, розрізняються залишки приймають райдужну кольорову схему, де N-кінець синій, а C-кінець червоний. (E) Білок-W у тому ж вигляді, що й у (A), а залишки на межі розділу білка-W:LH1 представлені стрижнями з прикріпленими позначками. (F) Білок-W повернутий на 90° відносно (E) та LH1αβ14 у мультяшному зображенні та відносно залишків на межі розділу у стовпчастому зображенні. Звисаючі залишки бета-поліпептиду позначені. Кофактор показано у вигляді смуги, колір якої відповідає рисунку 1, розкладений β-DDM показаний сірим кольором, а кисень показаний червоним. (G) Зображення на (F) повернуте на 180°, з помітними залишками міченого альфа-поліпептиду.
Білок-W заміщує гетеродимер αβ (15-й на рисунку 1F), тим самим запобігаючи замиканню петлі та нахилу перших трьох гетеродимерів αβ. Було помічено, що максимальний кут нахилу першого гетеродимера αβ-1 відносно нормалі плівки становив від 25° до 29° (рисунок 1, A та E), що було утворено нахилом αβ-1 від 2° до 8° в RC A, що є різким контрастом - LH116 (рисунок 1, B та F). Другий та третій гетеродимери нахилені під кутами від 12° до 22° та від 5° до 10° відповідно. Через стеричні перешкоди RC, нахил αβ-1 не включає другу пару αβ (що відповідає 16-му αβ на рисунку 1F), утворюючи таким чином чітку щілину в кільці LH1 (рисунок 1, A та E). Через відсутність двох гетеродимерів αβ, що супроводжується втратою чотирьох BChl та двох каротиноїдів, жоден з каротиноїдів не зв'язується зі скрученою субодиницею αβ-1, в результаті чого утворюється кільце LH114-W, що містить 13 каротиноїдів Vegetarian та 28 BChl. Оцінки локальної роздільної здатності двох комплексів у ділянках αβ1-7 нижчі, ніж для решти петлі LH1, що може відображати притаманну пластичність субодиниці LH1, що прилягає до сайту RC QB (Рисунок 4).
Зображення RC-LH114-W (A та B) та RC-LH116 (C та D) показано з того ж вигляду зверху/боку (A та B) (A та C) та поверхні порожнини, що й на рис. 1 (B та D). Кольорові клавіші показано праворуч.
Єдиним іншим характерним основним комплексом зі стехіометричним співвідношенням 1:14 є димер Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Однак білок W та PufX не мають очевидної гомології та мають значний вплив на відповідні структури LH1. PufX – це окремий TMH з N-кінцевим цитоплазматичним доменом, який взаємодіє з цитоплазматичною стороною субодиниці RC-H (13) у положенні, що відповідає Rps. palustris LH116αβ-16. PufX створює канал для обміну хіноном/хінолоном між RC-LH1 та комплексом цитохрому bcl та присутній у всіх основних комплексах Rba. sphaeroides (13). Хоча інтерфейс мономер-мономер знаходиться в Rba. Димер sphaeroides RC-LH1-PufX розташований у положенні зв'язування білка W в RC-LH114-W, а проміжок, індукований PufX та білком-W, знаходиться в еквівалентному положенні (Рисунок S7A). Проміжок у RC-LH114-W також вирівняний з гіпотетичним хіноновим каналом (8) Pseudomonas rosea LH1, який утворений пептидами, не пов'язаними з білком W або PufX (Рисунок S7B). Крім того, хіноновий канал у Blc. Смарагдово-зелений LH1, утворений шляхом виключення однієї γ-субодиниці (7), розташований у подібному положенні (Рисунок S7C). Хоча опосередковується різними білками, поява цих хінонових/хінолольних каналів у спільному положенні в комплексі RC-LH1, здається, є прикладом конвергентної еволюції, що вказує на те, що проміжок, створений білком W, може діяти як хіноновий канал.
Розрив у петлі LH114-W дозволяє утворювати безперервну мембранну область між внутрішнім простором комплексу RC-LH114-W та об'ємною мембраною (Рисунок 1G), а не з'єднує два домени через білкову пору, як у білках. Комплекс RC-LH116 подібний до замкнутого голкоподібного комплексу Tch (22) (Рисунок 1H). Оскільки дифузія хінону через мембрану швидша, ніж дифузія через вузький білковий канал, відкрита петля LH114-W може забезпечити швидший оборот RC, ніж закрита петля LH116, а дифузія хінону в RC може бути більш обмеженою. Щоб перевірити, чи впливає білок W на перетворення хінонів через RC, ми провели аналіз окислення цитохрому на певній концентрації убіхінону 2 (UQ2) (аналог природного UQ10 з коротшим ізопреновим хвостом) (Рисунок 2E). Хоча присутність хелатного хінону перешкоджає точному визначенню видимої константи Міхаеліса (RC-LH114-W та RC-LH116 підходять для 0,2±0,1 мкМ та 0,5±0,2 мкМ відповідно), максимальна швидкість RC-LH114-W (4,6±0,2 е-RC-1 с-1) на 28±5% більша, ніж у RC-LH116 (3,6±0,1 е-RC-1 с-1).
Спочатку ми оцінили, що білок-W присутній приблизно в 10% основного комплексу (16); тут коефіцієнти заповненості клітин росту при слабкому, середньому та сильному освітленні становлять 15±0,6%, 11±1% та 0,9±0,5% відповідно (Рисунок 2F). Кількісне порівняння мас-спектрометрії показало, що додавання гістидинової мітки не зменшило відносну кількість білка-W порівняно зі штамами дикого типу (P = 0,59), тому ці рівні не є артефактом модифікованого білка-W (Рисунок S10). Однак ця низька заповненість білка-W у комплексі RC-LH1 може дозволити деяким RC перевертати з прискореною швидкістю, тим самим пом'якшуючи повільніший обмін хінон/хінолон у комплексі RC-LH116. Ми помітили, що коефіцієнт заповненості при високому освітленні не відповідає останнім даним транскриптоміки, що вказує на те, що експресія гена pufW збільшується під впливом сильного світла (Рисунок S11) (23). Різниця між транскрипцією pufW та включенням білка W у комплекс RC-LH1 є заплутаною та може відображати складну регуляцію білка.
У RC-LH114-W виділено та змодельовано 6 молекул кардіоліпіну (CDL), 7 молекул фосфатидилхоліну (POPC), 1 молекулу фосфатидилгліцерину (POPG) та 29 молекул β-DDM: 6 молекул CDL, 24 молекули POPC, 2 молекули POPG та 12 молекул βDDM. RC-LH116 (Рисунок 5, A та B). У цих двох структурах CDL майже повністю розташований на цитоплазматичній стороні комплексу, тоді як POPC, POPG та β-DDM переважно розташовані на люмінальній стороні. Дві молекули ліпіду та детергенту були виділені в області αβ-1 - αβ-6 комплексу RC-LH114-W (Рисунок 5A), а п'ять - в еквівалентній області RC-LH116 (Рисунок 5B). Більше ліпідів було виявлено на іншій стороні комплексу, головним чином CDL, що накопичувалися між RC та αβ-7 - αβ-13 (Рисунок 5, A та B). Інші структурно розділені ліпіди та детергенти розташовані поза кільцем LH1, а добре розділені ацильні ланцюги простягаються між субодиницями LH1, попередньо позначеними як β-DDM в RC-LH114-W та визначеними як β-DDM в RC A суміш β-DDM та POPC-LH116. Подібні положення хелатуючих ліпідів та детергентів у нашій структурі вказують на те, що вони є фізіологічно значущими сайтами зв'язування (Рисунок S12A). Положення еквівалентних молекул у Tch також мають добру узгодженість. Gentle та Trv. Штам 970 RC-LH1s (Рисунок S12, B-E) (9, 12) та водневі зв'язки ліпідної головки показали досить добру консервативність у вирівнюванні послідовностей (Рисунок S13), що вказує на консервативний CDL, який зв'язується з RC (24), ці сайти можуть бути консервативними в комплексі RC-LH1.
(A та B) Пептиди RC-LH114-W (A) та RC-LH116 (B) представлені малюнками, а пігменти – паличками, згідно з кольоровою схемою на рисунку 1. Ліпіди показані червоним кольором, а детергенти – сірим. UQ, зв'язаний з сайтами RC QA та QB, позначений жовтим, тоді як ізольований UQ – синім. (C та D) Ті ж зображення, що й у (A) та (B), ліпіди опущені. (E–G) Збільшене зображення Q1(E), Q2(F) та Q3(G) з RC-LH116 з бічними ланцюгами, що впливають один на одного. Водневі зв'язки показані чорними пунктирними лініями.
У RC-LH116 як RC QA, так і QB UQ, які беруть участь у переносі електронів у процесі розділення зарядів, розкладаються у своїх сайтах зв'язування. Однак у RC-LH114-W хінон QB не був розділений і буде детально обговорено нижче. На додаток до хінонів QA та QB, дві хелатні молекули UQ (розташовані між кільцями RC та LH1) розподілені в структурі RC-LH114-W відповідно до їх добре розділених головних груп (розташованих у просторі Q1 та Q2 відповідно). Рисунок 5C). Дві ізопренові одиниці віднесені до Q1, і карта щільності розділяє повні 10 ізопренових хвостів Q2. У структурі RC-LH116 були розділені три хелатні молекули UQ10 (Q1-Q3, Рисунок 5D), і всі молекули мають чітку щільність по всьому хвосту (Рисунок 5, D-G). У двох структурах положення хінонових головних груп Q1 та Q2 мають чудову узгодженість (Рисунок S12F), і вони взаємодіють лише з RC. Q1 розташований на вході у W-щілину RC-LH114-W (Рисунок 1G та 5, C, D та E), а Q2 розташований поблизу сайту зв'язування QB (Рисунок 5, C, D та F). Консервативні залишки L-Trp143 та L-Trp269 дуже близькі до Q1 та Q2 та забезпечують потенційні π-стекінгові взаємодії (Рисунок 5, E та F, і Рисунок S12). L-Gln88, розташований на відстані 3,0 Å від дистального кисню Q1, забезпечує міцний водневий зв'язок (Рисунок 5E); цей залишок консервативний у всіх RC, крім найвіддаленішого зв'язку (Рисунок S13). L-Ser91 консервативно заміщений на Thr у більшості інших RC (Рисунок S13), знаходиться на відстані 3,8 Å від метильного кисню Q1 та може утворювати слабкі водневі зв'язки (Рисунок 5E). Q3, здається, не має специфічної взаємодії, але розташований у гідрофобній області між субодиницею RC-M та субодиницею LH1-α 5-6 (Рисунок 5, D та G). Q1, Q2 та Q3 або сусідні хелатні хінони також були виявлені у Tch. Gentle, Trv. Strain 970 та Blc. Структура ірису (9, 10, 12) вказує на консервативний допоміжний сайт зв'язування хінону в комплексі RC-LH1 (Рисунок S12G). П'ять розкладених UQ у RC-LH116 добре узгоджуються з 5,8±0,7 для кожного комплексу, визначеними за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), тоді як три розкладені UQ у RC-LH114-W нижчі за . Виміряне значення 6,2±0,3 (рис. S14) вказує на наявність нерозділених молекул UQ у структурі.
Псевдосиметричні L- та M-поліпептиди містять по п'ять TMH та утворюють гетеродимер, що поєднує один димер BChl, два мономери BChl, два мономери бактеріофага (BPh), одне негемове залізо та одну або дві молекули UQ10. Завдяки наявності водневих зв'язків на кінцевій кетонній групі та її відомому накопиченню в Rps, каротиноїди включаються до складу M-субодиниці, яка називається цис-3,4-дегідрородопін. Види (25). Домен зовнішньої мембрани RC-H закріплений на мембрані одним TMH. Загальна структура RC подібна до трисубодиниці RC споріднених видів (таких як Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Макроцикли BChl та BPh, каротиноїдний кароткий ланцюг та негемове залізо перекриваються в межах діапазону роздільної здатності цих структур, як і головна група UQ10 в сайті QA та хінон QB в RC-LH116 (Рисунок S15).
Наявність двох структур RC з різною швидкістю зайнятості сайтів QB надає нову можливість дослідити послідовні конформаційні зміни, що супроводжують зв'язування хінону QB. У комплексі RC-LH116 хінон QB розташований у повністю зв'язаному «проксимальному» положенні (26), але розділення RC-LH114-W не містить хінону QB. У RC-LH114-W немає хінону QB, що дивно, оскільки комплекс є активним, більш активним, ніж комплекс RC-LH116 зі структурно розділеним хіноном QB. Хоча два кільця LH1 хелатують близько шести хінонів, п'ять структурно розділені в закритому кільці RC-LH116, тоді як лише три структурно обмежені у відкритому кільці RC-LH114-W. Це збільшення структурного безладу може відображати швидше заміщення сайтів QB RC-LH114-W, швидшу кінетику хінону в комплексі та підвищену ймовірність перетину петлі LH1. Ми припускаємо, що відсутність UQ в сайті RC QB RC-LH114-W може бути результатом більш складного та активного комплексу, а сайт QB RC-LH114-W був негайно заморожений в процесі обороту UQ. Конкретна стадія (вхід до сайту QB був закритий) відображає конформацію цієї активності.
Без QB відбувається супутнє обертання L-Phe217 у положення, несумісне зі зв'язуванням UQ10, оскільки це спричинить просторове зіткнення з першою ізопреновою одиницею хвоста (Рисунок 6A). Крім того, очевидні основні конформаційні зміни, особливо спіраль de (коротка спіраль у петлі між TMH D та E), де L-Phe217 зміщується до кишені зв'язування QB, та обертання L-Tyr223 (Рисунок 6A), щоб розірвати водневий зв'язок з каркасом M-Asp45 та закрити вхід до сайту зв'язування QB (Рисунок 6B). Спіраль de повертається біля своєї основи, Cα L-Ser209 зміщується на 0,33 Å, тоді як L-Val221Cα зміщується на 3,52 Å. Немає спостережуваних змін у TMH D та E, які накладаються в обох структурах (Рисунок 6A). Наскільки нам відомо, це перша структура в природному RC, яка замикає сайт QB. Порівняння з повною (QB-зв'язаною) структурою показує, що перед тим, як хінон відновиться, необхідна конформаційна зміна, щоб він увійшов до хінону. L-Phe217 обертається, утворюючи π-стекінгову взаємодію з головною групою хінону, і спіраль зміщується назовні, дозволяючи скелету L-Gly222 та бічному ланцюгу L-Tyr223 утворювати мережу водневих зв'язків зі стабільною структурою водневих зв'язків (Рисунок 6, A та C).
(A) Перекриваюча голограмна (L-ланцюг, помаранчевий/M-ланцюг, пурпуровий) та апо- (сірий) структура, на якій ключові залишки відображені у вигляді стрижнеподібного зображення. UQ10 представлений жовтою смугою. Пунктирна лінія вказує на водневі зв'язки, утворені у всій структурі. (B та C) Поверхневе зображення аполіпопротеїну та всієї кільцевої структури, з виділенням кисню бічного ланцюга L-Phe217 синім кольором та L-Tyr223 червоним кольором відповідно. L-субодиниця помаранчева; M та H субодиниці не забарвлені. (D та E) Аполіпопротеїн (D) та цілі (E) сайти RC QB [розфарбовані за (A) відповідно] та Thermophilus thermophilus PSII (зелений, синій з пластиковим хіноном; PDB ID: 3WU2) Вирівнювання (58).
Несподівано, хоча доступні кілька структур QB-дефіцитних RC без LH1, конформаційні зміни, що спостерігаються в цьому дослідженні, раніше не повідомлялися. До них належать структура з дефіцитом QB з Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) та Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), всі з яких майже ідентичні їх загальній структурі QB. Ретельне дослідження 3PRC показало, що молекули детергенту LDAO (лаурилдиметиламіноксид) зв'язуються на вході в позицію QB, що може запобігти перебудові в закриту конформацію. Хоча LDAO не розкладається в тій самій позиції в 1EYS або 1OGV, ці RC готуються з використанням того ж детергенту і тому можуть мати той самий ефект. Кристалічна структура Rba. Sphaeroides RC, кокристалізовані з цитохромом с2 (PDB ID: 1L9B), також, здається, мають закритий сайт QB. Однак у цьому випадку N-кінцева область поліпептиду RC-M (взаємодіючи з сайтом зв'язування QB через H-зв'язок залишку Tyr на Q-спіралі) приймає неприродну конформацію, і конформаційна зміна QB далі не досліджується (30). Заспокоює те, що ми не спостерігали такої деформації поліпептиду M у структурі RC-LH114-W, яка майже така ж, як N-кінцева область RC-LH116 RC. Слід також зазначити, що після видалення антени LH1 на основі детергенту, RC аполіпопротеїну в PDB були розділені, що усунуло внутрішні пули хінонів та ліпіди в проміжку між RC та внутрішньою поверхнею навколишнього кільця LH1 (31, 32). RC залишається функціональним, оскільки він зберігає всі кофактори, за винятком розкладного QB-хінону, який є менш стабільним і часто втрачається під час процесу приготування (33). Крім того, відомо, що видалення LH1 та природних циклічних ліпідів з RC може впливати на функції, такі як скорочення тривалості життя стану P+QB з розділеним зарядом (31, 34, 35). Тому ми припускаємо, що існування локального кільця LH1, що оточує RC, може підтримувати «закритий» сайт QB, тим самим зберігаючи локальне середовище поблизу QB.
Хоча аполіпопротеїн (без хінону QB) та повна структура представляють лише два знімки оновлення сайту QB, а не серію подій, є ознаки того, що зв'язування може бути обмежене, щоб запобігти повторному зв'язуванню гідрохіноном для пригнічення інгібування субстрату. Взаємодія хінололу та хінону поблизу сайту QB аполіпопротеїну може бути різною, що призводить до його відторгнення RC. Давно було запропоновано, що конформаційні зміни відіграють певну роль у зв'язуванні та відновленні хінонів. Здатність заморожених RC відновлювати хінони після адаптації до темряви порушена (36); рентгенівська кристалографія показує, що це пошкодження зумовлене тим, що хінони QB утримуються в «дистальній» конформації приблизно на відстані 4,5 Å від активного проксимального положення (26, 37). Ми припускаємо, що ця дистальна конформація зв'язування є знімком проміжного стану між аполіпопротеїном та повною кільцевою структурою, яка відбувається після початкової взаємодії з хіноном та відкриття сайту QB.
Редукційні рецептори II типу, виявлені в комплексі PSII деяких фототрофних бактерій та ціанобактерій, водоростей та рослин, мають структурну та функціональну консервацію (38). Структурне вирівнювання, показане на рисунку 6 (D та E), підкреслює подібність між редукційними рецепторами PSII та сайтом QB бактеріального комплексу RC. Це порівняння вже давно є моделлю для вивчення тісно пов'язаних систем зв'язування та відновлення хінонів. Попередні публікації припускали, що конформаційні зміни супроводжуються відновленням хінонів за допомогою PSII (39, 40). Тому, враховуючи еволюційну консервацію RC, цей раніше неспостережуваний механізм зв'язування також може бути застосовним до сайту QB RC PSII у насичених киснем фототрофних рослин.
Штами Rps ΔpufW (немічена делеція pufW) та PufW-His (C-кінцевий 10x His-мічений білок-W, експресований з природного локусу pufW). Штам palustris CGA009 був описаний у нашій попередній роботі (16). Ці штами та ізогенний батьківський штам дикого типу були вилучені з морозильної камери шляхом штрихування невеликої кількості клітин на чашку PYE (кожна по 5 г/л) (зберігалася в LB при -80 °C, що містить 50% (мас./об.) гліцерину, білка, дріжджового екстракту та сукцинату) агару [1,5% (мас./об.)]. Чашку інкубували протягом ночі в темряві при кімнатній температурі в анаеробних умовах, а потім освітлювали білим світлом (~50 мкмоль/м²/с), що забезпечувалося галогенними лампами OSRAM 116-W (RS Components, Велика Британія), протягом 3-5 днів до появи однієї колонії. Одну колонію використовували для інокуляції 10 мл середовища M22+ (41), доповненого 0,1% (мас./об.) казамінокислот (далі - M22). Культуру вирощували в умовах низького вмісту кисню в темряві при температурі 34°C зі струшуванням зі швидкістю 180 об/хв протягом 48 годин, а потім 70 мл культури інокулювали за тих самих умов протягом 24 годин. Напіваеробну культуру об'ємом 1 мл використовували для інокуляції 30 мл середовища M22 в універсальній прозорій скляній пляшці об'ємом 30 мл з закручуючою кришкою та опромінювали з перемішуванням (~50 мкмоль/м²/с) протягом 48 годин за допомогою стерильної магнітної мішалки. Потім 30 мл культури інокулювали приблизно 1 літром культури за тих самих умов, яку потім використовували для інокуляції приблизно 9 літрів культури, освітленої при ~200 мкмоль/м²/с протягом 72 годин. Клітини збирали центрифугуванням при 7132 RCF протягом 30 хвилин, ресуспендували у ~10 мл 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) та зберігали при -20°C до потреби.
Після розморожування до ресуспендованих клітин додайте кілька кристалів дезоксирибонуклеази I (Merck, Велика Британія), лізоциму (Merck, Велика Британія) та дві таблетки інгібітора протеази холоферменту Roche (Merck, Велика Британія). У французькій комірці під тиском 20 000 psi (Aminco, США) клітини руйнували від 8 до 12 разів. Після видалення нерозчинних клітин та нерозчинних залишків центрифугуванням при 18 500 RCF протягом 15 хвилин при 4°C мембрану осаджували з пігментованого лізату центрифугуванням при 113 000 RCF протягом 2 годин при 43 000°C. Розчинну фракцію видаліть та ресуспендуйте забарвлену мембрану у 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) та гомогенізуйте до зникнення видимих ​​агрегатів. Суспендовану мембрану інкубували в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) (Anatrace, США), що містить 2% (мас./об.) β-DDM, протягом 1 години в темряві при 4°C з обережним перемішуванням. Потім центрифугували при 70°C для розчинення 150 000 RCF при 4°C протягом 1 години для видалення залишкових нерозчинних речовин.
Солюбілізуючу мембрану зі штаму ΔpufW наносили на 50 мл іонообмінну колонку DEAE Sepharose з трьома об'ємами колонки (CV) буфера для зв'язування [20 мМ трис-HCl (pH 8,0), що містить 0,03% (мас./об.) β-DDM]. Промивали колонку двома буферами для зв'язування CV, а потім промивали колонку двома буферами для зв'язування, що містять 50 мМ NaCl. Комплекс RC-LH116 елюювали лінійним градієнтом від 150 до 300 мМ NaCl (у буфері для зв'язування) при 1,75 CV, а решту комплексу для зв'язування елюювали буфером для зв'язування, що містить 300 мМ NaCl, при 0,5 CV. Збирали спектр поглинання між 250 та 1000 нм, підтримували фракцію зі співвідношенням поглинання (A880/A280) більше 1 при 880-280 нм, двічі розводили її у буфері для зв'язування та повторювали ту саму процедуру на колонці DEAE після очищення. Розбавте фракції зі співвідношеннями A880/A280 вище 1,7 та A880/A805 вище 3,0, проведіть третій раунд іонного обміну та залиште фракції зі співвідношеннями A880/A280 вище 2,2 та A880/A805 вище 5,0. Частково очищений комплекс концентрували до ~2 мл у центрифужному фільтрі Amicon 100 000 з молекулярною масою відсікання (MWCO) (Merck, Велика Британія) та завантажували на колонку для виключення за розміром Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, США), що містить 200 мМ буфер NaCl, а потім елюювали в тому ж буфері при 1,5 CV. Зберіть спектри поглинання фракції виключення за розміром та сконцентруйте спектри поглинання зі співвідношеннями A880/A280 понад 2,4 та A880/A805 понад 5,8 до 100 A880, і негайно використовуйте їх для підготовки або зберігання кріо-ТЕМ-сітки. Зберігайте при температурі -80°C до потреби.
Солюбілізуючу мембрану зі штаму PufW-His наносили на 20 мл колонку HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 мМ трис-HCl (pH 8,0), що містить 200 мМ NaCl та 0,03% (мас./мас.)) у буфері IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Колонку промивали п'ятьма CV буфера IMAC, а потім п'ятьма CV буфера IMAC, що містить 10 мМ гістидину. Основний комплекс елюювали з колонки п'ятьма буферами IMAC, що містять 100 мМ гістидину. Фракцію, що містить комплекс RC-LH114-W, концентрували до ~10 мл у резервуарі з перемішуванням, оснащеному фільтром Amicon 100 000 MWCO (Merck, Велика Британія), розводили у 20 разів буфером для зв'язування, а потім додавали до 25 мл. У колонці DEAE Sepharose заздалегідь використовували чотири CV, зв'язані з буфером. Промийте колонку чотирма буферами для зв'язування CV, потім елююйте комплекс на восьми CV на лінійному градієнті від 0 до 100 мМ NaCl (у буфері для зв'язування), а решта чотири CV містять 100 мМ буфер для зв'язування. Залишкові комплекси, елюйовані на хлориді натрію, об'єднані зі співвідношенням A880/A280 вище 2,4 та співвідношенням A880/A805 вище 4,6, концентрували до ~2 мл у відцентровому фільтрі Amicon 100 000 MWCO та заповнювали 1,5 CV IMAC на попередньо врівноваженій буфером колонці Superdex 200 16/600 для виключення розміру, а потім елюювали в тому ж буфері протягом 1,5 CV. Зберіть спектри поглинання фракцій виключення за розміром та концентруйте спектри поглинання зі співвідношеннями A880/A280 понад 2,1 та A880/A805 понад 4,6 до 100 A880, які негайно використовуються для приготування замороженої сітки TEM або зберігаються при температурі -80°C до потреби.
Для приготування низькотемпературних сіток TEM використовували іммерсійний морозильник Leica EM GP. Комплекс розводили в буфері IMAC до A880 50, а потім 5 мкл завантажували на щойно розряджену мідну сітку QUANTIFOIL 1.2/1.3 з вуглецевим покриттям (Agar Scientific, Велика Британія). Інкубуйте сітку при температурі 20°C та відносній вологості 60% протягом 30 секунд, потім промокніть її насухо протягом 3 секунд, а потім загасіть у рідкому етані при температурі -176°C.
Дані комплексу RC-LH114-W були записані на eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) за допомогою мікроскопа Titan Krios, який працює на прискорювальній напрузі 300 кВ, з номінальним збільшенням 130 000× та енергією проміжку 20 еВ. Для збору даних для запису зображень у режимі підрахунку використовувався Gatan 968 GIF Quantum з піковим детектором K2. Розмір каліброваного пікселя становить 1,048 Å, а потужність дози – 3,83 е-Å-2с-1. Плівку зібрали за 11 секунд та розділили на 40 частин. Використали область з вуглецевим покриттям для перефокусування мікроскопа, а потім зібрали по три плівки на отвір. Загалом було зібрано 3130 плівків зі значеннями розфокусування від -1 до -3 мкм.
Дані для комплексу RC-LH116 були зібрані за допомогою того ж мікроскопа в Лабораторії біоструктур Астербері (Університет Лідса, Велика Британія). Дані були зібрані в режимі підрахунку зі збільшенням 130 k, а розмір пікселя був калібрований до 1,065 Å з дозою 4,6 e-Å-2s-1. Фільм був записаний за 12 секунд і розділений на 48 частин. Загалом було зібрано 3359 плівок зі значеннями розфокусування від -1 до -3 мкм.
Вся обробка даних виконується в конвеєрі Relion 3.0 (42). Використовуйте Motioncorr 2 (43) для корекції руху променя шляхом зважування дози, а потім використовуйте CTFFIND 4.1 (44) для визначення параметра CTF (функції передачі контрасту). Типові фотомікрофотографії після цих початкових етапів обробки показані на рисунку 2. S16. Шаблон автоматичного вибору генерується шляхом ручного вибору приблизно 250 пікселів з 1000 частинок у 250-піксельному кадрі та відсутності еталонної двовимірної (2D) класифікації, тим самим відхиляючи ті класифікації, які відповідають забрудненню зразка або не мають помітних характеристик. Потім було виконано автоматичний вибір на всіх мікрофотографіях, і RC-LH114-W мав 849 359 частинок, а комплекс RC-LH116 – 476 547 частинок. Усі вибрані частинки пройшли два раунди нереференсної 2D-класифікації, і після кожного прогону частинки, що відповідають вуглецевій області, забрудненню зразка, не мають очевидних ознак або сильно перекриваються, відхиляються, в результаті чого 772 033 (90,9%) та 359 678 (75,5%) частинок використовуються для 3D-класифікації RC-LH114-W та RC-LH116 відповідно. Початкову 3D-референсну модель було створено за допомогою методу стохастичного градієнтного спуску. Використовуючи початкову модель як еталон, вибрані частинки класифікуються на чотири категорії в 3D. Використовуючи модель у цій категорії як еталон, виконують 3D-уточнення частинок у найбільшій категорії, потім використовують початковий 15Å низькочастотний фільтр, щоб покрити область розчинника, додають 6 пікселів м'яких країв та оброблюють пікселі для корекції передавальної функції модуляції піку Гатана K2 верхнього детектора. Для набору даних RC-LH114-W цю початкову модель було модифіковано шляхом видалення сильної щільності на краях маски (відірваної від щільності основного комплексу в UCSF Chimera). Отримані моделі (роздільна здатність RC-LH114-W та RC-LH116 становить 3,91 та 4,16 Å відповідно) використовуються як орієнтир для другого раунду 3D-класифікації. Використані частинки згруповані в початковий 3D-клас і не містять сильної кореляції з околицями. Перекриття або відсутність очевидних структурних особливостей. Після другого раунду 3D-класифікації було обрано категорію з найвищою роздільною здатністю [Для RC-LH114-W одна категорія становить 377 703 частинки (44,5%), для RC-LH116 є дві категорії, що складають 260 752 частинки (54,7%), де вони однакові лише при вирівнюванні після початкового обертання з невеликою різницею]. Вибрані частинки повторно екстрагуються в 400-піксельному боксі та уточнюються за допомогою 3D-удосконалення. Маска розчинника генерується з використанням початкового 15Å низькочастотного фільтра, 3-піксельного розширення карти та 3-піксельної м'якої маски. Використовуючи уточнення CTF для кожної частинки, корекцію руху для кожної частинки та другий раунд уточнення CTF для кожної частинки, 3D-удосконалення, маскування розчинником та пост-обробка виконуються після кожного кроку для подальшого уточнення отриманої текстури. Використовуючи граничне значення FSC (коефіцієнт кореляції оболонки Фур'є) 0,143, роздільна здатність кінцевих моделей RC-LH114-W та RC-LH116 становить 2,65 та 2,80 Å відповідно. Крива FSC кінцевої моделі показана на рисунку 2. S17.
Усі послідовності білків завантажено з UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Для побудови гомологічної моделі RC було використано SWISS-MODEL (45), яка містить послідовності білків RC-L, RC-M та RC-H, а кристалічну структуру Rba. sphaeroides було використано як шаблон (PDB ID: 5LSE) (46). Використайте інструмент «fit map» у UCSF Chimera, щоб підігнати згенеровану модель до карти (47), покращити структуру білка та додати кофактор [4×BChl a (назва залишку мономерної бібліотеки = BCL), 2×BPh a (BPH), один або два види UQ10 (U10), одне негемове залізо (Fe) та один 3,4-дигідрогексакарбонілхолін (QAK)] за допомогою Coot (48). Оскільки QAK недоступний у бібліотеці мономерів, його параметризували за допомогою інструменту eLBOW у PHENIX (49).
Далі було побудовано субодиницю LH1. Спочатку для автоматичного побудови частини послідовності LH1, використовуючи карту та послідовності білків LH1-α та LH1-β як вхідні дані, було використано інструмент автоматичного побудови в PHENIX (49). Виберіть найповнішу субодиницю LH1, витягніть її та завантажте в Coot, вручну додайте відсутню послідовність та вручну уточніть всю структуру перед додаванням двох BCl a (BCL) та спірилоксантину (CRT) [відповідно до відповідного Rps. Щільність комплексу LH1 та відомий вміст каротиноїдів. Види (17)]. Скопіюйте повну субодиницю LH1 та використовуйте інструмент UCSF Chimera «Docking Map Tool» для закріплення в сусідній немодельній області щільності LH1, а потім уточніть її в Coot; повторюйте процес, доки всі субодиниці LH1 не будуть змодельовані. Для структури RC-LH114-W, шляхом вилучення нерозподіленої щільності в Coot, білок сегментується від решти небілкових компонентів на карті USCF Chimera, і інструмент Autobuild використовується для встановлення початкової моделі та моделювання решти субодиниць (білок-W). У PHENIX (49). Додайте будь-які відсутні послідовності до отриманої моделі в Coot (48), а потім вручну уточніть всю субодиницю. Решта нерозподіленої щільності відповідає комбінації ліпідів (ідентифікатор бібліотеки мономерів PDB CDL = CDL, POPC = 6PL та POPG = PGT), детергенту β-DDM (LMT) та молекул UQ10 (U10). Використовуйте оптимізацію PHENIX (49) та ручну оптимізацію в Coot (48), щоб удосконалити повну початкову модель, доки статистика моделі та візуальна якість підгонки не можуть бути додатково покращені. Нарешті, використовуйте LocScale (50) для уточнення локальної карти, а потім виконайте кілька інших циклів моделювання нерозподіленої щільності та автоматичної та ручної оптимізації.
Відповідні пептиди, кофактори та інші ліпіди й хінони, зіставлені в межах їх відповідних щільностей, показані на рисунках 1 та 2. S18–S23. Статистична інформація кінцевої моделі наведена в таблиці S1.
Якщо не зазначено інше, спектри поглинання в УФ/Віз/Близькому ІЧ діапазоні були зібрані на спектрофотометрі Cary60 (Agilent, США) з інтервалами 1 нм від 250 нм до 1000 нм та часом інтегрування 0,1 с.
Розведіть зразок у кварцовій кюветі з довжиною смуги 2 мм до A880, рівного 1, та зберіть спектр поглинання між 400 та 1000 нм. Кругові дихроїчні спектри були зібрані на спектрополяриметрі Jasco 810 (Jasco, Японія) з інтервалами 1 нм між 400 нм та 950 нм зі швидкістю сканування 20 нм/хв.
Молярний коефіцієнт екстинкції визначають шляхом розведення основного комплексу до A880, приблизно 50. Розводять об'єм 10 мкл у 990 мкл буфера для зв'язування або метанолу та негайно збирають спектр поглинання, щоб мінімізувати деградацію BChl. Вміст BChl у кожному зразку метанолу розраховують за коефіцієнтом екстинкції при 771 нм, що становить 54,8 мМ-1 см-1, і визначають коефіцієнт екстинкції (51). Поділіть виміряну концентрацію BChl на 32 (RC-LH114-W) або 36 (RC-LH116), щоб визначити концентрацію основного комплексу, яка потім використовується для визначення спектру поглинання того ж зразка, зібраного в буфері. Коефіцієнт екстинкції. Для кожного зразка проводять три повторні вимірювання, і для розрахунку використовують середнє значення поглинання максимуму BChl Qy. Коефіцієнт екстинкції RC-LH114-W, виміряний при 878 нм, становить 3280±140 мМ-1 см-1, тоді як коефіцієнт екстинкції RC-LH116, виміряний при 880 нм, становить 3800±30 мМ-1 см-1.
UQ10 було кількісно визначено згідно з методом, описаним у (52). Коротко кажучи, обернено-фазову ВЕРХ (RP-HPLC) було проведено з використанням системи ВЕРХ Agilent 1200. Розчиніть приблизно 0,02 нмоль RC-LH116 або RC-LH114-W у 50 мкл суміші метанол:хлороформ 50:50, що містить 0,02% (мас./об.) хлориду заліза, та введіть попередньо врівноважену рідину Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 мм. Розчиніть у 1 мл-1 хв-1 при 40°C у розчиннику для ВЕРХ (метанол:2-пропанол 80:20) на колонці ×25 см. Виконайте ізократичне елюювання у розчиннику для ВЕРХ для контролю поглинання при 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноїди) та 780 нм (BChl) протягом 1 години. Пік на хроматограмі при 275 нм на 25,5 хвилині був інтегрований, і не містив жодних інших виявлених сполук. Інтегрована площа використовується для розрахунку молярної кількості екстрагованого UQ10 з посиланням на калібрувальну криву, розраховану шляхом введення чистих стандартів від 0 до 5,8 нмоль (Рисунок S14). Кожен зразок був проаналізований у трьох повторностях, і зареєстрована похибка відповідає стандартному відхиленню середнього значення.
Розчин, що містить комплекс RC-LH1 з максимальним поглинанням Qy 0,1, був приготований з 30 мкМ відновленого цитохрому с2 кінського серця (Merck, Велика Британія) та від 0 до 50 мкМ MUQ2 (Merck, Велика Британія). Три зразки об'ємом 1 мл були приготовані з кожною концентрацією UQ2 та інкубовані протягом ночі в темряві при 4°C для забезпечення повної адаптації до темряви перед вимірюванням. Розчин був завантажений у модульний спектрофотометр OLIS RSM1000, оснащений полум'яною решіткою 300 нм/500 ліній, вхідними щілинами 1,24 мм, середньою щілинами 0,12 мм та вихідними щілинами 0,6 мм. На вході фотоелементу зразка та опорного фотопомножувача розміщено фільтр з довжиною пропускання 600 нм для виключення збуджувального світла. Поглинання контролювали при 550 нм з часом інтегрування 0,15 с. Збуджувальне світло випромінюється світлодіодом M880F2 (Thorlabs Ltd., Велика Британія) з довжиною хвилі 880 нм (Thorlabs Ltd., Велика Британія) через оптоволоконний кабель з інтенсивністю 90% за допомогою контролера DC2200 (Thorlabs Ltd., Велика Британія) та випромінюється до джерела світла під кутом 90°. Вимірювальний промінь спрямований проти дзеркала, щоб повернути будь-яке світло, яке спочатку не було поглинено зразком. Контролюйте поглинання за 10 секунд до освітлення протягом 50 секунд. Потім поглинання додатково контролювали протягом 60 секунд у темряві, щоб оцінити ступінь, до якої хінолол спонтанно відновлює цитохром с23+ (див. Рисунок S8 для отримання необроблених даних).
Дані обробляли шляхом підгонки лінійної початкової швидкості в межах від 0,5 до 10 с (залежно від концентрації UQ2) та усереднення швидкостей усіх трьох зразків при кожній концентрації UQ2. Концентрацію RC-LH1, розраховану за відповідним коефіцієнтом екстинкції, використовували для перетворення швидкості в каталітичну ефективність, нанесену на графік в Origin Pro 2019 (OriginLab, США), та підгонку до моделі Міхаеліса-Ментена для визначення видимих ​​значень Km та Kcat.
Для вимірювань транзієнтного поглинання зразок RC-LH1 розводили до ~2 мкМ у буфері IMAC, що містив 50 мМ аскорбату натрію (Merck, США) та 0,4 мМ тербутину (Merck, США). Аскорбінова кислота використовується як жертовний донор електронів, а трет-бутаклофен – як інгібітор QB, щоб забезпечити відновленість основного донора RC (тобто відсутність фотоокислення) протягом усього процесу вимірювання. Приблизно 3 мл зразка додають до спеціальної обертової комірки (діаметром близько 0,1 м, 350 об/хв) з довжиною оптичного шляху 2 мм, щоб забезпечити достатньо часу для адаптації до темряви у зразка на лазерному шляху між імпульсами збудження. Використовуйте лазерні імпульси тривалістю ~100 фс для посилення лазерної системи Ti:Sapphire (Spectra Physics, США) для збудження зразка на довжині хвилі 880 нм з частотою повторення 1 кГц (20 нДж для ближнього інфрачервоного діапазону або 100 нДж для видимого діапазону). Перед збором даних зразок піддають впливу збуджувального світла приблизно на 30 хвилин. Експозиція призведе до інактивації контролю якості (можливо, зниження контролю якості один або два рази). Але зверніть увагу, що цей процес є оборотним, оскільки після тривалого періоду адаптації до темряви, RC повільно повернеться до активності контролю якості. Для вимірювання спектрів перехідних процесів із затримкою від -10 до 7000 пс використовувався спектрометр Helios (Ultrafast Systems, США). Використовуйте програмне забезпечення Surface Xplorer (Ultrafast Systems, США), щоб розгрупувати набори даних, а потім об'єднати їх та стандартизувати. Використовуйте програмний пакет CarpetView (Light Conversion Ltd., Литва), щоб отримати диференціальні спектри, пов'язані з розпадом, на основі об'єднаного набору даних, або використовуйте функцію, яка згортає кілька експонент з відгуком приладу, щоб узгодити спектральну еволюцію для однієї довжини хвилі в Origin (OriginLab, США).
Як згадувалося вище (53), було підготовлено фотосинтетичну плівку, що містить комплекс LH1, у якого відсутній як RC, так і периферична антена LH2. Мембрану розводили в 20 мМ трис-розчині (pH 8,0), а потім завантажували в кварцову кювету з оптичним шляхом 2 мм. Для збудження зразка використовували лазерний імпульс потужністю 30 нДж при 540 нм із часом затримки від -10 до 7000 пс. Обробляйте набір даних, як описано для зразка Rps.pal.
Мембрану осаджували центрифугуванням при 150 000 RCF протягом 2 годин при 4°C, а потім її поглинання при 880 нм ресуспендували у 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) та 200 мМ NaCl. Розчиняли мембрану, повільно помішуючи, у 2% (мас./об.) β-DDM протягом 1 години в темряві при 4°C. Зразок розводили у 100 мМ триетиламоній карбонаті (pH 8,0) (TEAB; Merck, Велика Британія) до концентрації білка 2,5 мг/мл (аналіз Bio-Rad). Подальшу обробку проводили за раніше опублікованим методом (54), починаючи з розведення 50 мкг білка в 50 мкл TEAB, що містить 1% (мас./об.) лаурату натрію (Merck, Велика Британія). Після обробки ультразвуком протягом 60 секунд його відновлювали 5 мМ трис(2-карбоксиетил)фосфіном (Merck, Велика Британія) при 37°C протягом 30 хвилин. Для S-алкілування зразок інкубували з 10 мМ метил S-метилтіометансульфонатом (Merck, Велика Британія) та додавали його з 200 мМ розчину ізопропанолу протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Протеолітичне розщеплення проводили шляхом додавання 2 мкг суміші трипсин/ендопротеїназа Lys-C (Promega, Велика Британія) та інкубували при 37°C протягом 3 годин. Лауратний поверхнево-активний агент екстрагували додаванням 50 мкл етилацетату та 10 мкл 10% (об./об.) трифтороцтової кислоти (TFA; Thermo Fisher Scientific, Велика Британія) та перемішуванням на вортексі протягом 60 секунд. Фазовий розділ стимулювали центрифугуванням при 15 700 RCF протягом 5 хвилин. Згідно з протоколом виробника, для ретельного відсмоктування та знесолення нижньої фази, що містить пептид, використовували спін-колонку C18 (Thermo Fisher Scientific, Велика Британія). Після сушіння вакуумним центрифугуванням зразок розчиняли у 0,5% TFA та 3% ацетонітрилі, а 500 нг аналізували за допомогою нанопотокової RP-хроматографії в поєднанні з мас-спектрометрією, використовуючи системні параметри, детально описані раніше.
Використовуйте MaxQuant версії 1.5.3.30 (56) для ідентифікації та кількісного визначення білків, щоб знайти базу даних протеому Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Дані протеоміки мас-спектрометрії були депоновані в ProteomeXchange Alliance через партнерський репозиторій PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) під ідентифікатором набору даних PXD020402.
Для аналізу за допомогою ВПХ у поєднанні з мас-спектрометрією з електророзпилювальною іонізацією, комплекс RC-LH1 був отриманий з Rps дикого типу. Використовуючи раніше опублікований метод (16), концентрація білка, отриманого в клітинах palustris, становила 2 мг/мл у 20 мМ Hepes (pH 7,8), 100 мМ NaCl та 0,03% (мас./об.) β- (аналіз Bio-Rad) DDM. Згідно з протоколом виробника, використали набір для 2D-очищення (GE Healthcare, США) для екстракції 10 мкг білка методом осадження та розчинили осад у 20 мкл 60% (об./об.) мурашиної кислоти (FA), 20% (об./об.) ацетонітрилу та 20% (об./об.) води. П'ять мікролітрів проаналізували за допомогою ВПХ (Dionex RSLC) у поєднанні з мас-спектрометрією (Maxis UHR-TOF, Bruker). Використовуйте колонку MabPac 1,2×100 мм (Thermo Fisher Scientific, Велика Британія) для розділення при 60°C та 100 мкл/хв⁻¹ з градієнтом від 85% (об./об.) розчинника A [0,1% (об./об.) FA та 0,02% (об./об.) водного розчину TFA] до 85% (об./об.) розчинника B [0,1% (об./об.) FA та 0,02% (об./об.) у 90% (об./об.) ацетонітрил TFA]. Використовуючи стандартне джерело електророзпилювальної іонізації та параметри за замовчуванням протягом більше 60 хвилин, мас-спектрометр отримує від 100 до 2750 m/z (співвідношення маси до заряду). За допомогою інструменту FindPept біоінформатичного порталу ресурсів ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) зіставте мас-спектр з субодиницями комплексу.
Клітини вирощували протягом 72 годин під 100 мл NF-низького (10 мкМм-2 с-1), середнього (30 мкМм-2 с-1) або сильного (300 мкМм-2 с-1) освітлення. Середовище M22 (середовище M22, в якому сульфат амонію відсутня, а сукцинат натрію замінено ацетатом натрію) у 100 мл пляшці з закручуючою кришкою (23). Протягом п'яти 30-секундних циклів скляні кульки розміром 0,1 мікрона додавали у співвідношенні об'ємів 1:1 для лізису клітин та охолоджували на льоду протягом 5 хвилин. Нерозчинну речовину, нерозбиті клітини та скляні кульки видаляли центрифугуванням при 16 000 RCF протягом 10 хвилин у настільній мікроцентрифузі. Мембрану розділяли на роторі Ti 70.1 зі 100 000 RCF у 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) з градієнтом сахарози 40/15% (мас./мас.) протягом 10 годин.
Як описано в нашій попередній роботі, імунодетекція His-мітки на PufW (16). Коротше кажучи, очищений основний комплекс (11,8 нМ) або мембрана, що містить таку ж концентрацію RC (визначену шляхом окислення, віднімаючи спектр зменшеної різниці та зіставляючи навантаження на забарвленому гелі) у 2x SDS-завантажувальному буфері (Merck, Велика Британія), розведеному двічі. Білки розділяли на репліці 12% біс-трис NuPage гелю (Thermo Fisher Scientific, Велика Британія). Гель забарвлювали Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Велика Британія) для завантаження та візуалізації субодиниці RC-L. Білок на другому гелі переносили на активовану метанолом полівініліденфторидну (PVDF) мембрану (Thermo Fisher Scientific, Велика Британія) для імуноферментного аналізу. Мембрану PVDF блокували в 50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (об./об.) Tween-20 та 5% (мас./об.) сухому знежиреному молоці, а потім інкубували з первинним антитілом проти His (у буфері для розведення антитіл [50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl та 0,05% (об./об.) Tween-20] у співвідношенні 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, США) протягом 4 годин. Після 3-разового промивання протягом 5 хвилин у буфері для антитіл, мембрану поєднували з вторинними антитілами проти миші на основі пероксидази хрону (Sigma-Aldrich, Велика Британія) (розведеними 1:10 000 у буфері для антитіл). Інкубували для можливості детекції (5 хвилин після 3 промивань у буфері для антитіл) з використанням хемілюмінесцентного субстрату WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Італія) та Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Велика Британія).
Шляхом малювання розподілу інтенсивності кожного забарвленого гелю або доріжки імуноферментного аналізу, інтегрування площі під піком та обчислення співвідношення інтенсивності RC-L (забарвлений гель) та білка-W (імуноферментний аналіз) у ImageJ (57) обробіть зображення. Ці співвідношення були перетворені на молярні співвідношення, припустивши, що співвідношення RC-L до білка-W у чистому зразку RC-LH114-W становило 1:1, та відповідно нормалізувавши весь набір даних.
Додаткові матеріали до цієї статті див. за посиланням http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Це стаття з відкритим доступом, що розповсюджується відповідно до умов ліцензії Creative Commons Attribution. Стаття дозволяє необмежене використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії за умови належного цитування оригінальної роботи.
Примітка: Ми просимо вас надати свою адресу електронної пошти лише для того, щоб людина, яку ви рекомендуєте для сторінки, знала, що ви хочете, щоб вона побачила цей лист, і що це не спам. Ми не збиратимемо жодних адрес електронної пошти.
Це питання використовується для перевірки, чи ви відвідувач, та запобігання автоматичному надсиланню спаму.
Девід Дж. К. Свейнсбері, Парк Цянь, Філіп Дж. Джексон, Кейтлін М. Феріс, Даріуш М. Нєдзведзький, Елізабет К. Мартін, Девід А. Фармер, Лорна А. Мелоун, Ребекка Ф. Томпсон, Ніл А. Ренсон, Деніел П. Канніфф, Марк Дж. Дікман, Дьюї Голтен, Крістін Кірмайєр, Ендрю Гічкок, К. Ніл Хантер
Структура комплексу світлової пастки 1 у реакційному центрі з високою роздільною здатністю дає нове розуміння динаміки хінонів.
Девід Дж. К. Свейнсбері, Парк Цянь, Філіп Дж. Джексон, Кейтлін М. Феріс, Даріуш М. Нєдзведзький, Елізабет К. Мартін, Девід А. Фармер, Лорна А. Мелоун, Ребекка Ф. Томпсон, Ніл А. Ренсон, Деніел П. Канніфф, Марк Дж. Дікман, Дьюї Голтен, Крістін Кірмайєр, Ендрю Гічкок, К. Ніл Хантер
Структура комплексу світлової пастки 1 у реакційному центрі з високою роздільною здатністю дає нове розуміння динаміки хінонів.
©2021 Американська асоціація сприяння розвитку науки. всі права захищені. AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.