Стаття є частиною дослідницької теми «Передові технології біоремедіації та процеси переробки синтетичних органічних сполук (СОС)». Переглянути всі 14 статей
Низькомолекулярні поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ), такі як нафталін та заміщені нафталіни (метилнафталін, нафтойна кислота, 1-нафтил-N-метилкарбамат тощо), широко використовуються в різних галузях промисловості та є генотоксичними, мутагенними та/або канцерогенними для організмів. Ці синтетичні органічні сполуки (СОС) або ксенобіотики вважаються пріоритетними забруднювачами та становлять серйозну загрозу для глобального довкілля та здоров'я населення. Інтенсивність діяльності людини (наприклад, газифікація вугілля, переробка нафти, викиди транспортних засобів та сільськогосподарське застосування) визначає концентрацію, долю та транспортування цих повсюдних та стійких сполук. На додаток до фізичних та хімічних методів обробки/видалення, зелені та екологічно чисті технології, такі як біоремедіація, які використовують мікроорганізми, здатні повністю розкладати ПОС або перетворювати їх на нетоксичні побічні продукти, стали безпечною, економічно ефективною та перспективною альтернативою. Різні види бактерій, що належать до типів Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia та Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus та Paenibacillus) та Actinobacteria (Rhodococcus та Arthrobacter) у ґрунтовій мікробіоті, продемонстрували здатність розкладати різні органічні сполуки. Метаболічні дослідження, геноміка та метагеномний аналіз допомагають нам зрозуміти катаболічну складність та різноманітність, присутні в цих простих формах життя, що може бути додатково застосовано для ефективної біодеградації. Тривале існування поліакумулятивних ароматичних речовин (ПАВ) призвело до появи нових фенотипів деградації шляхом горизонтального переносу генів з використанням генетичних елементів, таких як плазміди, транспозони, бактеріофаги, геномні острови та інтегративні кон'югаційні елементи. Системна біологія та генна інженерія специфічних ізолятів або модельних спільнот (консорціумів) можуть забезпечити комплексну, швидку та ефективну біоремедіацію цих ПАВ завдяки синергетичним ефектам. У цьому огляді ми зосереджуємося на різних метаболічних шляхах та різноманітності, генетичному складі та різноманітності, а також клітинних реакціях/адаптаціях бактерій, що деградують нафталін та заміщений нафталін. Це надасть екологічну інформацію для польового застосування та оптимізації штамів для ефективної біоремедіації.
Швидкий розвиток галузей промисловості (нафтохімія, сільське господарство, фармацевтика, текстильні барвники, косметика тощо) сприяв світовому економічному процвітанню та підвищенню рівня життя. Цей експоненціальний розвиток призвів до виробництва великої кількості синтетичних органічних сполук (СОС), які використовуються для виробництва різноманітної продукції. До цих чужорідних сполук або СОС належать поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ), пестициди, гербіциди, пластифікатори, барвники, фармацевтичні препарати, органофосфати, антипірени, леткі органічні розчинники тощо. Вони викидаються в атмосферу, водні та наземні екосистеми, де мають багатовимірний вплив, спричиняючи шкідливий вплив на різні біоформи шляхом зміни фізико-хімічних властивостей та структури угруповань (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Багато ароматичних забруднювачів мають сильний та руйнівний вплив на багато неушкоджених екосистем/гарячих точок біорізноманіття (наприклад, коралові рифи, арктичні/антарктичні льодовикові щити, високогірні озера, глибоководні відкладення тощо) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Нещодавні геомікробіологічні дослідження показали, що відкладення синтетичних органічних речовин (наприклад, ароматичних забруднювачів) та їх похідних на поверхнях штучних споруд (забудованого середовища) (наприклад, об'єктів культурної спадщини та пам'ятників з граніту, каменю, дерева та металу) прискорює їхню деградацію (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Діяльність людини може посилити та погіршити біологічну деградацію пам'ятників та будівель через забруднення повітря та зміну клімату (Liu et al. 2020). Ці органічні забруднювачі реагують з водяною парою в атмосфері та осідають на споруді, спричиняючи фізичну та хімічну деградацію матеріалу. Біодеградація широко визнається як небажані зміни зовнішнього вигляду та властивостей матеріалів, спричинені живими організмами, що впливають на їх збереження (Pochon and Jaton, 1967). Подальша мікробна дія (метаболізм) цих сполук може знизити структурну цілісність, ефективність збереження та культурну цінність (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). З іншого боку, у деяких випадках мікробна адаптація та реакція на ці структури виявилася корисною, оскільки вони утворюють біоплівки та інші захисні кірки, що знижують швидкість гниття/розкладання (Martino, 2016). Тому розробка ефективних довгострокових стратегій сталого збереження кам'яних, металевих та дерев'яних пам'яток вимагає глибокого розуміння ключових процесів, що беруть участь у цьому процесі. Порівняно з природними процесами (геологічні процеси, лісові пожежі, виверження вулканів, реакції рослин та бактерій), діяльність людини призводить до викиду великих обсягів поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) та іншого органічного вуглецю (ОРВ) в екосистеми. Багато поліароматичних ароматичних речовин (ПАВ), що використовуються в сільському господарстві (інсектициди та пестициди, такі як ДДТ, атразин, карбарил, пентахлорфенол тощо), промисловості (сира нафта, нафтогаз/відходи, пластмаси, отримані з нафти, ПХБ, пластифікатори, миючі засоби, дезінфікуючі засоби, фуміганти, ароматизатори та консерванти), засобах особистої гігієни (сонцезахисні засоби, дезінфікуючі засоби, засоби від комах та поліциклічні мускуси) та боєприпасах (вибухові речовини, такі як 2,4,6-ТНТ), є потенційними ксенобіотиками, які можуть впливати на здоров'я планети (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna and Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Цей список можна розширити, включивши сполуки, отримані з нафти (мазут, мастильні матеріали, асфальтени), високомолекулярні біопластики та іонні рідини (Amde et al., 2015). У таблиці 1 перелічені різні ароматичні забруднювачі та їх застосування в різних галузях промисловості. В останні роки антропогенні викиди летких органічних сполук, а також вуглекислого газу та інших парникових газів почали зростати (Dvorak et al., 2017). Однак антропогенний вплив значно перевищує природний. Крім того, ми виявили, що низка ЛОС зберігається в багатьох середовищах навколишнього середовища та була визначена як нові забруднювачі з негативним впливом на біоми (Рисунок 1). Екологічні установи, такі як Агентство з охорони навколишнього середовища США (USEPA), включили багато з цих забруднювачів до свого списку пріоритетів через їхні цитотоксичні, генотоксичні, мутагенні та канцерогенні властивості. Тому необхідні суворі правила утилізації та ефективні стратегії обробки/видалення відходів із забруднених екосистем. Різні фізичні та хімічні методи обробки, такі як піроліз, окислювальна термічна обробка, аерація повітря, захоронення на полігонах, спалювання тощо, є неефективними та дорогими, а також утворюють корозійні, токсичні та важко оброблювані побічні продукти. Зі зростанням глобальної екологічної обізнаності, мікроорганізми, здатні розкладати ці забруднювачі та їх похідні (такі як галогеновані, нітро-, алкільні та/або метильні), привертають дедалі більшу увагу (Fennell et al., 2004; Haritash and Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Використання цих місцевих мікроорганізмів-кандидатів окремо або в змішаних культурах (колоніях) для видалення ароматичних забруднювачів має переваги з точки зору екологічної безпеки, вартості, ефективності, результативності та сталості. Дослідники також досліджують інтеграцію мікробних процесів з електрохімічними окисно-відновними методами, а саме біоелектрохімічними системами (БЕС), як перспективну технологію очищення/видалення забруднювачів (Huang et al., 2011). Технологія BES привертає все більшу увагу завдяки своїй високій ефективності, низькій вартості, екологічній безпеці, роботі за кімнатної температури, біосумісним матеріалам та здатності відновлювати цінні побічні продукти (наприклад, електроенергію, паливо та хімічні речовини) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Поява високопродуктивного секвенування геному та інструментів/методів оміки надала велику кількість нової інформації про генетичну регуляцію, протеоміку та флуксоміку реакцій різних мікроорганізмів-деградаторів. Поєднання цих інструментів із системною біологією ще більше поглибило наше розуміння вибору та точного налаштування цільових катаболічних шляхів у мікроорганізмів (тобто метаболічного дизайну) для досягнення ефективної та результативної біодеградації. Щоб розробити ефективні стратегії біоремедіації з використанням відповідних мікроорганізмів-кандидатів, нам необхідно розуміти біохімічний потенціал, метаболічне різноманіття, генетичний склад та екологію (аутоекологію/синекологію) мікроорганізмів.
Рис. 1. Джерела та шляхи поширення низькомолекулярних ПАВ через різні середовища навколишнього середовища та різні фактори, що впливають на біоту. Пунктирні лінії представляють взаємодію між елементами екосистеми.
У цьому огляді ми спробували узагальнити дані про деградацію простих поліароматичних ароматичних сполук (ПАВ), таких як нафталін та заміщені нафталіни, різними бактеріальними ізолятами, охоплюючи метаболічні шляхи та різноманітність, ферменти, що беруть участь у деградації, склад/вміст та різноманітність генів, клітинні реакції та різні аспекти біоремедіації. Розуміння біохімічного та молекулярного рівнів допоможе у визначенні відповідних штамів-господарів та їх подальшій генній інженерії для ефективної біоремедіації таких пріоритетних забруднювачів. Це допоможе у розробці стратегій створення специфічних для місця розташування бактеріальних консорціумів для ефективної біоремедіації.
Наявність великої кількості токсичних та небезпечних ароматичних сполук (що задовольняють правило Хюккеля 4n + 2π електронів, n = 1, 2, 3, …) становить серйозну загрозу для різних середовищ навколишнього середовища, таких як повітря, ґрунт, осади, а також поверхневі та ґрунтові води (Puglisi et al., 2007). Ці сполуки мають поодинокі бензольні кільця (моноциклічні) або множинні бензольні кільця (поліциклічні), розташовані в лінійній, кутовій або кластерній формі, та демонструють стабільність (стабільність/нестабільність) у навколишньому середовищі завдяки високій негативній резонансній енергії та інертності (інертності), що можна пояснити їхньою гідрофобністю та відновленим станом. Коли ароматичне кільце додатково заміщується метильними (-CH3), карбоксильними (-COOH), гідроксильними (-OH) або сульфонатними (-HSO3) групами, воно стає більш стабільним, має сильнішу спорідненість до макромолекул та біоакумулює в біологічних системах (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Деякі низькомолекулярні поліциклічні ароматичні вуглеводні (НМВАВ), такі як нафталін та його похідні [метилнафталін, нафтойна кислота, нафталінсульфонат та 1-нафтил N-метилкарбамат (карбарил)], були включені Агентством з охорони навколишнього середовища США до списку пріоритетних органічних забруднювачів як генотоксичні, мутагенні та/або канцерогенні (Cerniglia, 1984). Попадання цього класу НМ-ПАВ у навколишнє середовище може призвести до біоакумуляції цих сполук на всіх рівнях харчового ланцюга, тим самим впливаючи на здоров'я екосистем (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Джерела та шляхи потрапляння ПАВ до біоти зумовлені, головним чином, міграцією та взаємодією між різними компонентами екосистеми, такими як ґрунт, підземні води, поверхневі води, сільськогосподарські культури та атмосфера (Arey and Atkinson, 2003). На рисунку 1 показано взаємодію та розподіл різних низькомолекулярних ПАВ в екосистемах та їхні шляхи потрапляння до біоти/людини. ПАВ осідають на поверхнях внаслідок забруднення повітря, а також через міграцію (дрейф) викидів транспортних засобів, промислових вихлопних газів (газифікація вугілля, спалювання та виробництво коксу) та їх осадження. Промислова діяльність, така як виробництво синтетичного текстилю, барвників та фарб; консервація деревини; обробка гуми; виробництво цементу; виробництво пестицидів; та сільськогосподарське застосування є основними джерелами ПАВ у наземних та водних системах (Bamforth and Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Дослідження показали, що ґрунти в приміських та міських районах, поблизу автомагістралей та у великих містах більш схильні до поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) через викиди від електростанцій, опалення житлових приміщень, навантаження від повітряного та дорожнього руху, а також будівельну діяльність (Suman et al., 2016). (2008) показали, що рівень ПАВ у ґрунті поблизу доріг у Новому Орлеані, штат Луїзіана, США, сягав 7189 мкг/кг, тоді як на відкритому просторі він становив лише 2404 мкг/кг. Аналогічно, рівні ПАВ, що досягали 300 мкг/кг, були зареєстровані в районах поблизу місць газифікації вугілля в кількох містах США (Kanaly and Harayama, 2000; Bamforth and Singleton, 2005). Повідомлялося, що ґрунти різних індійських міст, таких як Делі (Sharma et al., 2008), Агра (Dubey et al., 2014), Мумбаї (Kulkarni and Venkataraman, 2000) та Вішакхапатнам (Kulkarni et al., 2014), містять високі концентрації ПАВ. Ароматичні сполуки легше адсорбуються на частинках ґрунту, органічній речовині та глинистих мінералах, стаючи таким чином основними поглиначами вуглецю в екосистемах (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Основними джерелами ПАВ у водних екосистемах є опади (вологі/сухі опади та водяна пара), міський стік, скидання стічних вод, поповнення ґрунтових вод тощо (Srogi, 2007). За оцінками, близько 80% ПАВ у морських екосистемах походять від опадів, седиментації та скидання стічних вод (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Вищі концентрації поліароматичних ароматизаторів (ПАВ) у поверхневих водах або фільтраті з місць захоронення твердих відходів зрештою потрапляють у ґрунтові води, що створює серйозну загрозу для здоров'я населення, оскільки понад 70% населення Південної та Південно-Східної Азії п'є ґрунтові води (Duttagupta et al., 2019). Нещодавнє дослідження Duttagupta et al. (2020) аналізів річкових (32) та ґрунтових (235) вод із Західної Бенгалії, Індія, показало, що приблизно 53% міських жителів та 44% сільських жителів (загалом 20 мільйонів жителів) можуть зазнавати впливу нафталіну (4,9–10,6 мкг/л) та його похідних. Різні моделі землекористування та збільшення видобутку ґрунтових вод вважаються основними факторами, що контролюють вертикальне перенесення (адвекцію) низькомолекулярних ПАВ у підземних водах. Було виявлено, що сільськогосподарські стоки, скиди комунальних та промислових стічних вод, а також скиди твердих відходів/сміття зазнають впливу ПАВ у річкових басейнах та підземних відкладеннях. Атмосферні опади ще більше посилюють забруднення ПАВ. Високі концентрації поліароматичних ароматичних сполук (ПАВ) та їх алкільних похідних (загалом 51) були зареєстровані в річках/водозбірних басейнах по всьому світу, таких як річки Фрейзер, Луан, Денсо, Міссурі, Анакостія, Ебро та Делавер (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). У відкладеннях басейну річки Ганг нафталін та фенантрен були виявлені як найбільш значущі (виявлені у 70% зразків) (Duttagupta et al., 2019). Крім того, дослідження показали, що хлорування питної води може призвести до утворення більш токсичних оксигенованих та хлорованих ПАВ (Manoli and Samara, 1999). ПАВ накопичуються в зернових, фруктах та овочах в результаті поглинання рослинами із забруднених ґрунтів, ґрунтових вод та опадів (Fismes et al., 2002). Багато водних організмів, таких як риба, мідії, молюски та креветки, забруднені ПАВ через споживання забрудненої їжі та морської води, а також через тканини та шкіру (Mackay and Fraser, 2000). Методи приготування/обробки, такі як гриль, запікання, копчення, смаження, сушіння, випікання та приготування їжі на вугіллі, також можуть призвести до значної кількості ПАВ у харчових продуктах. Це значною мірою залежить від вибору коптильного матеріалу, вмісту фенольних/ароматичних вуглеводнів, процесу приготування, типу нагрівача, вмісту вологи, постачання кисню та температури горіння (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАВ) також були виявлені в молоці в різних концентраціях (0,75–2,1 мг/л) (Girelli et al., 2014). Накопичення цих поліароматичних ароматизаторів (ПАВ) у їжі також залежить від фізико-хімічних властивостей їжі, тоді як їхній токсичний вплив пов'язаний з фізіологічними функціями, метаболічною активністю, абсорбцією, розподілом та розподілом в організмі (Mechini et al., 2011).
Токсичність та шкідливий вплив поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) відомі вже давно (Cherniglia, 1984). Низькомолекулярні поліциклічні ароматичні вуглеводні (НМ-ПАВ) (від двох до трьох кілець) можуть ковалентно зв'язуватися з різними макромолекулами, такими як ДНК, РНК та білки, і є канцерогенними (Santarelli et al., 2008). Через свою гідрофобну природу вони розділені ліпідними мембранами. У людини монооксигенази цитохрому P450 окислюють ПАВ до епоксидів, деякі з яких є високореактивними (наприклад, епоксид бедіолу) і можуть призвести до трансформації нормальних клітин у злоякісні (Marston et al., 2001). Крім того, продукти трансформації ПАВ, такі як хінони, феноли, епоксиди, діоли тощо, є більш токсичними, ніж вихідні сполуки. Деякі ПАВ та їхні метаболічні проміжні продукти можуть впливати на гормони та різні ферменти в метаболізмі, тим самим негативно впливаючи на ріст, центральну нервову систему, репродуктивну та імунну системи (Swetha and Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Повідомлялося, що короткочасний вплив низькомолекулярних ПАВ викликає порушення функції легень та тромбоз у астматиків, а також збільшує ризик раку шкіри, легень, сечового міхура та шлунково-кишкового тракту (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Дослідження на тваринах також показали, що вплив ПАВ може мати негативний вплив на репродуктивну функцію та розвиток і може спричинити катаракту, пошкодження нирок та печінки, а також жовтяницю. Було показано, що різні продукти біотрансформації ПАВ, такі як діоли, епоксиди, хінони та вільні радикали (катіони), утворюють аддукти ДНК. Було показано, що стабільні аддукти змінюють механізм реплікації ДНК, тоді як нестабільні аддукти можуть депуринувати ДНК (головним чином до аденіну, а іноді й до гуаніну); обидва можуть генерувати помилки, що призводять до мутацій (Schweigert et al. 2001). Крім того, хінони (бензо-/пан-) можуть генерувати активні форми кисню (АФК), що завдає смертельних пошкоджень ДНК та інших макромолекул, тим самим впливаючи на функцію/життєздатність тканин (Ewa and Danuta 2017). Повідомлялося, що хронічний вплив низьких концентрацій пірену, біфенілу та нафталіну викликає рак у експериментальних тварин (Diggs et al. 2012). Через їхню летальну токсичність, очищення/видалення цих поліароматичних ароматизаторів (ПАВ) з уражених/забруднених ділянок є пріоритетним завданням.
Для видалення поліацетатних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) із забруднених ділянок/середовищ використовувалися різні фізичні та хімічні методи. Такі процеси, як спалювання, дехлорування, УФ-окислення, фіксація та екстракція розчинниками, мають багато недоліків, включаючи утворення токсичних побічних продуктів, складність процесу, проблеми безпеки та регулювання, низьку ефективність та високу вартість. Однак мікробна біодеградація (так звана біоремедіація) є перспективним альтернативним підходом, який передбачає використання мікроорганізмів у формі чистих культур або колоній. Порівняно з фізичними та хімічними методами, цей процес є екологічно чистим, неінвазивним, економічно ефективним та сталим. Біоремедіація може проводитися на ураженій ділянці (in situ) або на спеціально підготовленій ділянці (ex situ) і тому вважається більш сталим методом ремедіації, ніж традиційні фізичні та хімічні методи (Juhasz and Naidu, 2000; Andreoni and Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Розуміння етапів мікробного метаболізму, що беруть участь у розкладанні ароматичних забруднювачів, має величезні наукові та економічні наслідки для екологічної та екологічної стійкості. За оцінками, 2,1×10^18 грамів вуглецю (C) зберігається в осадових породах та органічних сполуках (тобто нафті, природному газі та вугіллі, тобто викопному паливі) у всьому світі, що робить значний внесок у глобальний вуглецевий цикл. Однак швидка індустріалізація, видобуток викопного палива та діяльність людини виснажують ці літосферні резервуари вуглецю, щорічно викидаючи в атмосферу приблизно 5,5×10^15 г органічного вуглецю (як забруднювачів) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Більша частина цього органічного вуглецю потрапляє в наземні та морські екосистеми шляхом седиментації, транспортування та стоку. Крім того, нові синтетичні забруднювачі, отримані з викопного палива, такі як пластмаси, пластифікатори та стабілізатори пластику (фталати та їх ізомери), серйозно забруднюють морські, ґрунтові та водні екосистеми та їх біоту, тим самим посилюючи глобальні кліматичні ризики. Різні види мікропластику, нанопластику, фрагментів пластику та їх токсичних мономерних продуктів, отриманих з поліетилентерефталату (ПЕТ), накопичилися в Тихому океані між Північною Америкою та Південно-Східною Азією, утворюючи «Велику тихоокеанську сміттєву пляму», завдаючи шкоди морському життю (Newell et al., 2020). Наукові дослідження довели, що неможливо видалити такі забруднювачі/відходи жодними фізичними чи хімічними методами. У цьому контексті найкориснішими мікроорганізмами є ті, що здатні окислювально метаболізувати забруднювачі на вуглекислий газ, хімічну енергію та інші нетоксичні побічні продукти, які зрештою вступають в інші процеси кругообігу поживних речовин (H, O, N, S, P, Fe тощо). Таким чином, розуміння мікробної екофізіології мінералізації ароматичних забруднювачів та її екологічного контролю має вирішальне значення для оцінки мікробного вуглецевого циклу, чистого вуглецевого бюджету та майбутніх кліматичних ризиків. Враховуючи нагальну потребу у видаленні таких сполук з навколишнього середовища, з'явилися різні еко-індустрії, зосереджені на чистих технологіях. Як альтернатива, утилізація промислових відходів/відходів хімічних речовин, накопичених в екосистемах (тобто підхід «відходи до багатства»), вважається одним із стовпів циркулярної економіки та цілей сталого розвитку (Close et al., 2012). Тому розуміння метаболічних, ферментативних та генетичних аспектів цих потенційних кандидатів на деградацію має першорядне значення для ефективного видалення та біоремедіації таких ароматичних забруднювачів.
Серед багатьох ароматичних забруднювачів ми звертаємо особливу увагу на низькомолекулярні ПАВ, такі як нафталін та заміщені нафталіни. Ці сполуки є основними компонентами палива, отриманого з нафти, текстильних барвників, споживчих товарів, пестицидів (нафталінів та репелентів від комах), пластифікаторів та танінів, і тому широко поширені в багатьох екосистемах (Preuss et al., 2003). Нещодавні звіти підкреслюють накопичення концентрацій нафталіну в водоносних відкладеннях, ґрунтових водах та підземних ґрунтах, зонах вадози та руслах річок, що свідчить про його біоакумуляцію в навколишньому середовищі (Duttagupta et al., 2019, 2020). У таблиці 2 підсумовано фізико-хімічні властивості, застосування та вплив нафталіну та його похідних на здоров'я. Порівняно з іншими високомолекулярними ПАВ, нафталін та його похідні менш гідрофобні, більш розчинні у воді та широко поширені в екосистемах, тому їх часто використовують як модельні субстрати для вивчення метаболізму, генетики та метаболічного різноманіття ПАВ. Велика кількість мікроорганізмів здатна метаболізувати нафталін та його похідні, і доступна вичерпна інформація про їхні метаболічні шляхи, ферменти та регуляторні особливості (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Крім того, нафталін та його похідні визначені як прототипи сполук для оцінки забруднення навколишнього середовища через їх високу чисельність та біодоступність. Агентство з охорони навколишнього середовища США оцінює, що середній рівень нафталіну становить 5,19 мкг на кубічний метр від сигаретного диму, головним чином від неповного згоряння, та від 7,8 до 46 мкг від побічного диму, тоді як вплив креозоту та нафталіну у 100-10 000 разів вищий (Preuss et al. 2003). Зокрема, було виявлено, що нафталін має видо-, регіонально- та статево-специфічну респіраторну токсичність та канцерогенність. На основі досліджень на тваринах Міжнародне агентство з дослідження раку (IARC) класифікувало нафталін як «можливий канцероген для людини» (Група 2B)1. Вплив заміщених нафталінів, переважно шляхом інгаляції або парентерального (перорального) введення, викликає пошкодження легеневої тканини та збільшує частоту виникнення пухлин легень у щурів та мишей (Національна токсикологічна програма 2). Гострі наслідки включають нудоту, блювання, біль у животі, діарею, головний біль, сплутаність свідомості, рясне потовиділення, лихоманку, тахікардію тощо. З іншого боку, повідомлялося, що карбаматний інсектицид широкого спектру дії карбарил (1-нафтил N-метилкарбамат) є токсичним для водних безхребетних, амфібій, медоносних бджіл та людей, і було показано, що він пригнічує ацетилхолінестеразу, викликаючи параліч (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Тому розуміння механізмів мікробної деградації, генетичної регуляції, ферментативних та клітинних реакцій має вирішальне значення для розробки стратегій біоремедіації в забрудненому середовищі.
Таблиця 2. Детальна інформація про фізико-хімічні властивості, використання, методи ідентифікації та пов'язані з ними захворювання нафталіну та його похідних.
У забруднених нішах гідрофобні та ліпофільні ароматичні забруднювачі можуть спричиняти різноманітні клітинні ефекти на навколишній мікробіом (спільноту), такі як зміни текучості мембран, проникності мембран, набухання ліпідного двошарового шару, порушення передачі енергії (ланцюг транспорту електронів/рушійна сила протонів) та активність мембранно-асоційованих білків (Sikkema et al., 1995). Крім того, деякі розчинні проміжні продукти, такі як катехоли та хінони, генерують активні форми кисню (АФК) та утворюють аддукти з ДНК та білками (Penning et al., 1999). Таким чином, велика кількість таких сполук в екосистемах чинить селективний тиск на мікробні спільноти, змушуючи їх ставати ефективними деградаторами на різних фізіологічних рівнях, включаючи поглинання/транспорт, внутрішньоклітинну трансформацію, асиміляцію/утилізацію та компартменталізацію.
Пошук у базі даних рибосом Project-II (RDP-II) показав, що з середовищ або збагачувальних культур, забруднених нафталіном або його похідними, було виділено загалом 926 видів бактерій. Група Proteobacteria мала найбільшу кількість представників (n = 755), далі йшли Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) та некласифіковані бактерії (8) (Рисунок 2). Представники γ-Proteobacteria (Pseudomonadales та Xanthomonadales) домінували у всіх грамнегативних групах з високим вмістом G+C (54%), тоді як Clostridiales та Bacillales (30%) були грампозитивними групами з низьким вмістом G+C. Повідомлялося, що Pseudomonas (найбільша кількість, 338 видів) здатні розкладати нафталін та його метильні похідні в різних забруднених екосистемах (вугільна смола, нафта, сира нафта, шлам, розливи нафти, стічні води, органічні відходи та звалища), а також в неушкоджених екосистемах (ґрунт, річки, відкладення та підземні води) (Рисунок 2). Більше того, дослідження збагачення та метагеномний аналіз деяких із цих регіонів показали, що некультивовані види Legionella та Clostridium можуть мати деградаційну здатність, що вказує на необхідність культивування цих бактерій для вивчення нових шляхів та метаболічного різноманіття.
Рис. 2. Таксономічне різноманіття та екологічний розподіл представників бактерій у середовищах, забруднених нафталіном та його похідними.
Серед різних мікроорганізмів, що розкладають ароматичні вуглеводні, більшість здатні розкладати нафталін як єдине джерело вуглецю та енергії. Послідовність подій, пов'язаних з метаболізмом нафталіну, була описана для Pseudomonas sp. (штами: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 та CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 та інші штами (ND6 та AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis and Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Метаболізм ініціюється багатокомпонентною діоксигеназою [нафталіндіоксигеназа (NDO), діоксигеназа, що гідроксилює кільце], яка каталізує окислення одного з ароматичних кілець нафталіну, використовуючи молекулярний кисень як інший субстрат, перетворюючи нафталін на цис-нафталендіол (Рисунок 3). Цис-дигідродіол перетворюється на 1,2-дигідроксинафталін дегідрогеназою. Розщеплюючий кільце фермент... Діоксигеназа, 1,2-дигідроксинафталіндіоксигеназа (12DHNDO), перетворює 1,2-дигідроксинафталін на 2-гідроксихромен-2-карбонову кислоту. Ферментативна цис-транс-ізомеризація утворює транс-о-гідроксибензиліденпіруват, який розщеплюється гідратазною альдолазою на саліциловий альдегід та піруват. Органічний кислий піруват був першою сполукою C3, отриманою з вуглецевого скелета нафталіну та спрямованою в центральний вуглецевий шлях. Крім того, NAD+-залежна саліцилальдегіддегідрогеназа перетворює саліцилальдегід на саліцилову кислоту. Метаболізм на цій стадії називається «верхнім шляхом» деградації нафталіну. Цей шлях дуже поширений у більшості бактерій, що деградують нафталін. Однак є кілька винятків; наприклад, у термофільної Bacillus hamburgii 2 деградація нафталіну ініціюється нафталін-2,3-діоксигеназою з утворенням 2,3-дигідроксинафталін (Annweiler та ін., 2000).
Рисунок 3. Шляхи деградації нафталіну, метилнафталіну, нафтоївої кислоти та карбарилу. Обведені числа позначають ферменти, відповідальні за послідовне перетворення нафталіну та його похідних у наступні продукти. 1 — нафталіндіоксигеназа (NDO); 2, цис-дигідродіолдегідрогеназа; 3, 1,2-дигідроксинафталіндіоксигеназа; 4, ізомераза 2-гідроксихромен-2-карбонової кислоти; 5, транс-O-гідроксибензиліденпіруватгідратаза-альдолаза; 6, саліцилальдегіддегідрогеназа; 7, саліцилат-1-гідроксилаза; 8, катехол-2,3-діоксигеназа (C23DO); 9, 2-гідроксимуконат-напівальдегідрогеназа; 10, 2-оксопент-4-еноатгідратаза; 11, 4-гідрокси-2-оксопентaноат-альдолаза; 12, ацетальдегіддегідрогеназа; 13, катехол-1,2-діоксигеназа (C12DO); 14, муконатциклозомераза; 15, муконолактондельта-ізомераза; 16, β-кетоадипатенолактонгідролаза; 17, β-кетоадипатсукциніл-КоА-трансфераза; 18, β-кетоадипат-КоА-тіолаза; 19, сукциніл-КоА: ацетил-КоА-сукцинілтрансфераза; 20, саліцилат-5-гідроксилаза; 21 – гентизат-1,2-діоксигеназа (GDO); 22, малеїлпіруватізомераза; 23, фумарилпіруватгідролаза; 24, метилнафталінгідроксилаза (NDO); 25, гідроксиметилнафталіндегідрогеназа; 26, нафтальдегіддегідрогеназа; 27, 3-формілсаліцилова кислота оксидаза; 28, гідроксиізофталатдекарбоксилаза; 29, карбарилгідролаза (CH); 30, 1-нафтол-2-гідроксилаза.
Залежно від організму та його генетичного складу, отримана саліцилова кислота далі метаболізується або катехоловим шляхом за допомогою саліцилат-1-гідроксилази (S1H), або гентизатним шляхом за допомогою саліцилат-5-гідроксилази (S5H) (Рисунок 3). Оскільки саліцилова кислота є основним проміжним продуктом у метаболізмі нафталіну (верхній шлях), етапи від саліцилової кислоти до проміжного продукту TCA часто називають нижчим шляхом, а гени організовані в один оперон. Зазвичай можна побачити, що гени в опероні верхнього шляху (nah) та опероні нижчого шляху (sal) регулюються спільними регуляторними факторами; наприклад, NahR та саліцилова кислота діють як індуктори, дозволяючи обом оперонам повністю метаболізувати нафталін (Phale et al., 2019, 2020).
Крім того, катехол циклічно розщеплюється до 2-гідроксимуконат-напівальдегіду через мета-шлях катехол-2,3-діоксигеназою (C23DO) (Yen et al., 1988) та далі гідролізується 2-гідроксимуконат-напівальдегідгідролазою з утворенням 2-гідроксипент-2,4-дієнової кислоти. Потім 2-гідроксипент-2,4-дієноат перетворюється на піруват та ацетальдегід гідратазою (2-оксопент-4-еноатгідратаза) та альдолазою (4-гідрокси-2-оксопентаноат-альдолаза), а потім надходить у центральний вуглецевий шлях (Рисунок 3). Альтернативно, катехол циклічно розщеплюється до цис,цис-муконату через орто-шлях катехол-1,2-оксигеназою (C12DO). Муконатциклоізомераза, муконолактонізомераза та β-кетоадипат-ноллактонгідролаза перетворюють цис,цис-муконат на 3-оксоадипат, який надходить у центральний вуглецевий шлях через сукциніл-КоА та ацетил-КоА (Nozaki et al., 1968) (Рисунок 3).
У гентизатному (2,5-дигідроксибензоатному) шляху ароматичне кільце розщеплюється гентизат-1,2-діоксигеназою (GDO) з утворенням малеїлпірувату. Цей продукт може бути безпосередньо гідролізований до пірувату та малату, або може бути ізомеризований з утворенням фумарилпірувату, який потім може бути гідролізований до пірувату та фумарату (Larkin and Day, 1986). Вибір альтернативного шляху спостерігався як у грамнегативних, так і у грампозитивних бактерій на біохімічному та генетичному рівнях (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Грамнегативні бактерії (Pseudomonas) віддають перевагу використанню саліцилової кислоти, яка є індуктором метаболізму нафталіну, декарбоксилюючи її до катехолу за допомогою саліцилат-1-гідроксилази (Gibson and Subramanian, 1984). З іншого боку, у грампозитивних бактерій (Rhodococcus) саліцилат-5-гідроксилаза перетворює саліцилову кислоту на гентизинову, тоді як саліцилова кислота не має індуктивного впливу на транскрипцію генів нафталіну (Grund et al., 1992) (Рисунок 3).
Повідомлялося, що такі види, як Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas та Mycobacterium, можуть розкладати монометилнафталін або диметилнафталін (Dean-Raymond and Bartha, 1975; Cane and Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Серед них шлях деградації 1-метилнафталіну та 2-метилнафталіну Pseudomonas sp. CSV86 був чітко вивчений на біохімічному та ферментативному рівнях (Mahajan et al., 1994). 1-Метилнафталін метаболізується двома шляхами. Спочатку ароматичне кільце гідроксилюється (незаміщене кільце метилнафталіну) з утворенням цис-1,2-дигідрокси-1,2-дигідро-8-метилнафталіну, який далі окислюється до метилсаліцилату та метилкатехолу, а потім після розриву кільця потрапляє в центральний вуглецевий шлях (Рисунок 3). Цей шлях називається «шляхом джерела вуглецю». У другому «шляху детоксикації» метильна група може бути гідроксильована за допомогою NDO з утворенням 1-гідроксиметилнафталіну, який далі окислюється до 1-нафтої кислоти та виводиться в культуральне середовище як тупиковий продукт. Дослідження показали, що штам CSV86 не здатний рости на 1- та 2-нафтої кислоті як єдиному джерелі вуглецю та енергії, що підтверджує його шлях детоксикації (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). У 2-метилнафталіні метильна група піддається гідроксилюванню гідроксилазою з утворенням 2-гідроксиметилнафталіну. Крім того, незаміщене кільце нафталінового кільця піддається гідроксилюванню з утворенням дигідродіолу, який окислюється до 4-гідроксиметилкатехолу в серії ферментативних реакцій і вступає в центральний вуглецевий шлях через шлях розщеплення мета-кільця. Аналогічно, повідомлялося, що S. paucimobilis 2322 використовує NDO для гідроксилювання 2-метилнафталіну, який далі окислюється з утворенням метилсаліцилату та метилкатехолу (Dutta et al., 1998).
Нафтойні кислоти (заміщені/незаміщені) є побічними продуктами детоксикації/біотрансформації, що утворюються під час деградації метилнафталіну, фенантрену та антрацену та вивільняються у відпрацьоване культуральне середовище. Повідомлялося, що ґрунтовий ізолят Stenotrophomonas maltophilia CSV89 здатний метаболізувати 1-нафтойну кислоту як джерело вуглецю (Phale et al., 1995). Метаболізм починається з дигідроксилювання ароматичного кільця з утворенням 1,2-дигідрокси-8-карбоксинафталіну. Отриманий діол окислюється до катехолу через 2-гідрокси-3-карбоксибензиліденпіруват, 3-формілсаліцилову кислоту, 2-гідроксиізофталеву кислоту та саліцилову кислоту та потрапляє в центральний вуглецевий шлях через шлях розщеплення мета-кільця (Рисунок 3).
Карбарил – це пестицид нафтилкарбамату. З часів Зеленої революції в Індії в 1970-х роках використання хімічних добрив і пестицидів призвело до збільшення викидів поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) з неточкових джерел у сільському господарстві (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). За оцінками, 55% (85 722 000 гектарів) від загальної площі сільськогосподарських угідь в Індії обробляється хімічними пестицидами. Протягом останніх п'яти років (2015–2020) сільськогосподарський сектор Індії щорічно використовував в середньому від 55 000 до 60 000 тонн пестицидів (Департамент кооперативів та добробуту фермерів, Міністерство сільського господарства, Уряд Індії, серпень 2020 р.). На північній та центральній рівнинах Гангу (штати з найбільшою чисельністю населення та щільністю населення) використання пестицидів на сільськогосподарських культурах є поширеним, переважаючими інсектицидами. Карбарил (1-нафтил-N-метилкарбамат) – це карбаматний інсектицид широкого спектру дії, помірно- та високотоксичний, який використовується в сільському господарстві Індії в середній кількості 100–110 тонн. Він зазвичай продається під торговою назвою Sevin і використовується для боротьби з комахами (попелицями, вогняними мурахами, бліхами, кліщами, павуками та багатьма іншими шкідниками на відкритому повітрі), що вражають різноманітні сільськогосподарські культури (кукурудзу, сою, бавовну, фрукти та овочі). Деякі мікроорганізми, такі як Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus та Arthrobacter, також можуть використовуватися для боротьби з іншими шкідниками. Повідомлялося, що RC100 може розкладати карбарил (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Шлях розкладу карбарилу був ретельно вивчений на біохімічному, ферментативному та генетичному рівнях в ґрунтових ізолятах Pseudomonas sp. Штами C4, C5 та C6 (Swetha and Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (рис. 3). Метаболічний шлях починається з гідролізу ефірного зв'язку карбарилгідролазою (CH) з утворенням 1-нафтолу, метиламіну та вуглекислого газу. Потім 1-нафтол перетворюється на 1,2-дигідроксинафталін 1-нафтолгідроксилазою (1-NH), який далі метаболізується через центральний вуглецевий шлях через саліцилат та гентизат. Повідомлялося, що деякі карбарилдеградуючі бактерії метаболізують його до саліцилової кислоти шляхом розщеплення орто-кільця катехолу (Larkin and Day, 1986; Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). Примітно, що бактерії, що деградують нафталін, переважно метаболізують саліцилову кислоту через катехол, тоді як карбарилдеградуючі бактерії воліють метаболізувати саліцилову кислоту гентизатним шляхом.
Похідні нафталінсульфонової кислоти/дисульфонової кислоти та нафтиламінсульфонової кислоти можуть бути використані як проміжні продукти у виробництві азобарвників, змочувальних агентів, диспергаторів тощо. Хоча ці сполуки мають низьку токсичність для людини, оцінки цитотоксичності показали, що вони смертельні для риб, дафній та водоростей (Greim et al., 1994). Повідомлялося, що представники роду Pseudomonas (штами A3, C22) ініціюють метаболізм шляхом подвійного гідроксилювання ароматичного кільця, що містить групу сульфонової кислоти, з утворенням дигідродіолу, який далі перетворюється на 1,2-дигідроксинафталін шляхом спонтанного розщеплення сульфітної групи (Brilon et al., 1981). Отриманий 1,2-дигідроксинафталін катаболізується класичним нафталіновим шляхом, тобто катехоловим або гентизатним шляхом (Рисунок 4). Було показано, що амінонафталінсульфонова кислота та гідроксинафталінсульфонова кислота можуть бути повністю розкладені змішаними бактеріальними консорціумами з комплементарними катаболічними шляхами (Nortemann et al., 1986). Було показано, що один член консорціуму десульфуризує амінонафталінсульфонову кислоту або гідроксинафталінсульфонову кислоту шляхом 1,2-діоксигенації, тоді як аміносаліцилат або гідроксисаліцилат вивільняється в культуральне середовище як тупиковий метаболіт і згодом поглинається іншими членами консорціуму. Нафталіндисульфонова кислота є відносно полярною, але погано біорозкладною і тому може метаболізуватися різними шляхами. Перше десульфуризування відбувається під час регіоселективного дигідроксилювання ароматичного кільця та сульфоновокислотної групи; друге десульфуризування відбувається під час гідроксилювання 5-сульфосаліцилової кислоти саліциловою 5-гідроксилазою з утворенням гентизинової кислоти, яка вступає в центральний вуглецевий шлях (Brilon et al., 1981) (Рисунок 4). Ферменти, що відповідають за деградацію нафталіну, також відповідають за метаболізм сульфонату нафталіну (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Рисунок 4. Метаболічні шляхи деградації нафталінсульфонату. Числа всередині кіл позначають ферменти, відповідальні за метаболізм нафтилсульфонату, подібні/ідентичні ферментам, описаним на Рис. 3.
Низькомолекулярні ПАВ (НМ-ПАВ) є відновлюваними, гідрофобними та погано розчинними, тому не схильні до природного розпаду/деградації. Однак аеробні мікроорганізми здатні окислювати їх, поглинаючи молекулярний кисень (O2). Ці ферменти переважно належать до класу оксидоредуктаз і можуть виконувати різні реакції, такі як гідроксилювання ароматичного кільця (моно- або дигідроксилювання), дегідрування та розрив ароматичного кільця. Продукти, отримані в результаті цих реакцій, знаходяться у вищому ступені окислення та легше метаболізуються через центральний вуглецевий шлях (Phale et al., 2020). Повідомлялося, що ферменти в шляху деградації є індуцибельними. Активність цих ферментів дуже низька або незначна, коли клітини вирощуються на простих джерелах вуглецю, таких як глюкоза або органічні кислоти. У таблиці 3 наведено різні ферменти (оксигенази, гідролази, дегідрогенази, оксидази тощо), що беруть участь у метаболізмі нафталіну та його похідних.
Таблиця 3. Біохімічні характеристики ферментів, відповідальних за деградацію нафталіну та його похідних.
Радіоізотопні дослідження (18O2) показали, що включення молекулярного O2 в ароматичні кільця оксигеназами є найважливішим кроком в активації подальшого біодеградації сполуки (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Включення одного атома кисню (O) з молекулярного кисню (O2) в субстрат ініціюється ендогенними або екзогенними монооксигеназами (також званими гідроксилазами). Інший атом кисню відновлюється до води. Екзогенні монооксигенази відновлюють флавін за допомогою NADH або NADPH, тоді як в ендомонооксигеназах флавін відновлюється субстратом. Положення гідроксилювання призводить до різноманітності в утворенні продукту. Наприклад, саліцилат-1-гідроксилаза гідроксилює саліцилову кислоту в положенні C1, утворюючи катехол. З іншого боку, багатокомпонентна саліцилат-5-гідроксилаза (що містить субодиниці редуктази, фередоксину та оксигенази) гідроксилює саліцилову кислоту в положенні C5, утворюючи гентизинову кислоту (Yamamoto et al., 1965).
Діоксигенази включають два атоми O2 у субстрат. Залежно від утворених продуктів, їх поділяють на кільцегідроксилюючі діоксигенази та діоксигенази, що розщеплюють кільце. Кільцегідроксилюючі діоксигенази перетворюють ароматичні субстрати на цис-дигідродіоли (наприклад, нафталін) і широко поширені серед бактерій. На сьогоднішній день показано, що організми, що містять кільцегідроксилюючі діоксигенази, здатні рости на різних джерелах ароматичного вуглецю, і ці ферменти класифікуються як NDO (нафталін), толуолдіоксигеназа (TDO, толуол) та біфенілдіоксигеназа (BPDO, біфеніл). Як NDO, так і BPDO можуть каталізувати подвійне окислення та гідроксилювання бічного ланцюга різних поліциклічних ароматичних вуглеводнів (толуолу, нітротолуолу, ксилолу, етилбензолу, нафталіну, біфенілу, флуорену, індолу, метилнафталіну, нафталінсульфонату, фенантрену, антрацену, ацетофенону тощо) (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO - це багатокомпонентна система, що складається з оксидоредуктази, фередоксину та оксигеназного компонента, що містить активний центр (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Каталітична одиниця NDO складається з великої α-субодиниці та малої β-субодиниці, розташованих у конфігурації α3β3. НДО належить до великої родини оксигеназ, а його α-субодиниця містить сайт Ріске [2Fe-2S] та мононуклеарне негемове залізо, що визначає субстратну специфічність НДО (Parales et al., 1998). Як правило, в одному каталітичному циклі два електрони від відновлення піридинового нуклеотиду переносяться на іон Fe(II) в активному центрі через редуктазу, фередоксин та сайт Ріске. Відновлювальні еквіваленти активують молекулярний кисень, що є необхідною умовою для дигідроксилювання субстрату (Ferraro et al., 2005). На сьогоднішній день лише кілька НДО були очищені та детально охарактеризовані з різних штамів, а генетичний контроль шляхів, що беруть участь у деградації нафталіну, був детально вивчений (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Діоксигенази, що розщеплюють кільце (ендо- або орто-кільцерозщеплюючі ферменти та екзодіол- або мета-кільцерозщеплюючі ферменти), діють на гідроксильовані ароматичні сполуки. Наприклад, діоксигеназою, що розщеплює орто-кільце, є катехол-1,2-діоксигеназа, тоді як діоксигеназою, що розщеплює мета-кільце, є катехол-2,3-діоксигеназа (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Окрім різних оксигеназ, існують також різні дегідрогенази, що відповідають за дегідрування ароматичних дигідродіолів, спиртів та альдегідів та використовують NAD+/NADP+ як акцептори електронів, які є одними з важливих ферментів, що беруть участь у метаболізмі (Gibson and Subramanian, 1984; Shaw and Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Такі ферменти, як гідролази (естерази, амідази), є другим важливим класом ферментів, які використовують воду для розщеплення ковалентних зв'язків і демонструють широку субстратну специфічність. Карбарилгідролаза та інші гідролази вважаються компонентами периплазми (трансмембрани) у представників грамнегативних бактерій (Kamini et al., 2018). Карбарил має як амідний, так і ефірний зв'язок; тому він може гідролізуватися як естеразою, так і амідазою з утворенням 1-нафтолу. Повідомлялося, що карбарил у штамі Rhizobium rhizobium AC10023 та штамі Arthrobacter RC100 функціонує як естераза та амідаза відповідно. Карбарил у штамі Arthrobacter RC100 також функціонує як амідаза. Було показано, що RC100 гідролізує чотири інсектициди класу N-метилкарбамату, такі як карбарил, метоміл, мефенамінова кислота та XMC (Hayaatsu et al., 2001). Повідомлялося, що CH у Pseudomonas sp. C5pp може діяти на карбарил (100% активність) та 1-нафтилацетат (36% активність), але не на 1-нафтилацетамід, що вказує на те, що він є естеразою (Trivedi et al., 2016).
Біохімічні дослідження, закономірності регуляції ферментів та генетичний аналіз показали, що гени деградації нафталіну складаються з двох індукованих регуляторних одиниць або «оперонів»: nah («висхідний шлях», що перетворює нафталін на саліцилову кислоту) та sal («низхідний шлях», що перетворює саліцилову кислоту на центральний вуглецевий шлях через катехол). Саліцилова кислота та її аналоги можуть діяти як індуктори (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). У присутності глюкози або органічних кислот оперон репресується. На рисунку 5 показано повну генетичну організацію деградації нафталіну (у формі оперона). Було описано кілька названих варіантів/форм гена nah (ndo/pah/dox), які мають високу гомологію послідовностей (90%) серед усіх видів Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Гени висхідного шляху нафталіну загалом розташовані в консенсусному порядку, як показано на рисунку 5A. Також повідомлялося, що інший ген, nahQ, бере участь у метаболізмі нафталіну та зазвичай розташований між nahC та nahE, але його фактична функція залишається нез'ясованою. Аналогічно, ген nahY, відповідальний за чутливий до нафталіну хемотаксис, був виявлений на дистальному кінці nah оперону у деяких представників. У Ralstonia sp. ген U2, що кодує глутатіон-S-трансферазу (gsh), був розташований між nahAa та nahAb, але не впливав на характеристики утилізації нафталіну (Zylstra et al., 1997).
Рисунок 5. Генетична організація та різноманітність, що спостерігаються під час деградації нафталіну серед видів бактерій; (A) Верхній шлях нафталіну, метаболізм нафталіну до саліцилової кислоти; (B) Нижній шлях нафталіну, саліцилова кислота через катехол до центрального вуглецевого шляху; (C) саліцилова кислота через гентизат до центрального вуглецевого шляху.
«Нижній шлях» (sal-оперон) зазвичай складається з nahGTHINLMOKJ та перетворює саліцилат на піруват та ацетальдегід через шлях розщеплення катехол-метацикліну. Було виявлено, що ген nahG (що кодує саліцилатгідроксилазу) консервативний на проксимальному кінці оперону (рис. 5B). Порівняно з іншими штамами, що деградують нафталін, у P. putida CSV86 nah- та sal-оперони є тандемними та дуже тісно пов'язаними (близько 7,5 кб). У деяких грамнегативних бактерій, таких як Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 та P. putida AK5, нафталін метаболізується як центральний вуглецевий метаболіт через гентизатний шлях (у формі sgp/nag-оперону). Генна касета зазвичай представлена ​​у формі nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, де nagR (що кодує регулятор типу LysR) розташований у верхньому кінці (Рисунок 5C).
Карбарил вступає в центральний вуглецевий цикл через метаболізм 1-нафтолу, 1,2-дигідроксинафталіну, саліцилової кислоти та гентизинової кислоти (Рисунок 3). На основі генетичних та метаболічних досліджень було запропоновано розділити цей шлях на «висхідний» (перетворення карбарилу в саліцилову кислоту), «середній» (перетворення саліцилової кислоти в гентизинову кислоту) та «низхідний» (перетворення гентизинової кислоти в проміжні продукти центрального вуглецевого шляху) (Singh et al., 2013). Геномний аналіз C5pp (суперконтиг A, 76,3 kb) показав, що ген mcbACBDEF бере участь у перетворенні карбарилу на саліцилову кислоту, потім mcbIJKL у перетворенні саліцилової кислоти на гентизинову кислоту, а mcbOQP у перетворенні гентизинової кислоти на центральні вуглецеві проміжні продукти (фумарат і піруват, Trivedi et al., 2016) (Рисунок 6).
Повідомлялося, що ферменти, що беруть участь у розкладанні ароматичних вуглеводнів (включаючи нафталін та саліцилову кислоту), можуть індукуватися відповідними сполуками та інгібуватися простими джерелами вуглецю, такими як глюкоза або органічні кислоти (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Серед різних метаболічних шляхів нафталіну та його похідних, регуляторні особливості нафталіну та карбарилу були певною мірою вивчені. Для нафталіну гени як у вищестоящому, так і в нижньому шляхах регулюються NahR, транс-активним позитивним регулятором типу LysR. Він необхідний для індукції гена nah саліциловою кислотою та його подальшої експресії на високому рівні (Yen and Gunsalus, 1982). Крім того, дослідження показали, що інтегративний фактор хазяїна (IHF) та XylR (сигма 54-залежний транскрипційний регулятор) також є критичними для транскрипційної активації генів у метаболізмі нафталіну (Ramos et al., 1997). Дослідження показали, що ферменти шляху розкриття мета-кільця катехолу, а саме катехол-2,3-діоксигеназа, індукуються у присутності нафталіну та/або саліцилової кислоти (Basu et al., 2006). Дослідження показали, що ферменти шляху розкриття орто-кільця катехолу, а саме катехол-1,2-діоксигеназа, індукуються у присутності бензойної кислоти та цис,цис-муконату (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
У штамі C5pp п'ять генів, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR та mcbS, кодують регулятори, що належать до родини транскрипційних регуляторів LysR/TetR, відповідальних за контроль деградації карбарилу. Було виявлено, що гомологічний ген mcbG найбільш тісно пов'язаний з регулятором типу LysR PhnS (58% ідентичність амінокислот), що бере участь у метаболізмі фенантрену у Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Було виявлено, що ген mcbH бере участь у проміжному шляху (перетворення саліцилової кислоти на гентизинову кислоту) та належить до транскрипційного регулятора типу LysR NagR/DntR/NahR у Pseudomonas та Burkholderia. Повідомлялося, що члени цієї родини розпізнають саліцилову кислоту як специфічну ефекторну молекулу для індукції генів деградації. З іншого боку, три гени, mcbN, mcbR та mcbS, що належать до транскрипційних регуляторів типу LysR та TetR, були ідентифіковані в нижньому шляху (метаболіти гентизатно-центрального вуглецевого шляху).
У прокаріотів процеси горизонтального переносу генів (придбання, обмін або перенесення) через плазміди, транспозони, профаги, геномні острови та інтегративні кон'югативні елементи (ICE) є основними причинами пластичності в бактеріальних геномах, що призводить до отримання або втрати специфічних функцій/ознак. Це дозволяє бактеріям швидко адаптуватися до різних умов навколишнього середовища, забезпечуючи потенційні адаптивні метаболічні переваги для хазяїна, такі як деградація ароматичних сполук. Метаболічні зміни часто досягаються шляхом точного налаштування оперонів деградації, їх регуляторних механізмів та специфічності ферментів, що сприяє деградації ширшого спектру ароматичних сполук (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Було виявлено, що генні касети для деградації нафталіну розташовані на різних мобільних елементах, таких як плазміди (кон'югативні та некон'югативні), транспозони, геноми, ICE та комбінації різних видів бактерій (Рисунок 5). У Pseudomonas G7 оперони nah та sal плазміди NAH7 транскрибуються в однаковій орієнтації та є частиною дефектного транспозона, для мобілізації якого потрібна транспозаза Tn4653 (Sota et al., 2006). У штамі Pseudomonas NCIB9816-4 ген був виявлений на кон'югативній плазміді pDTG1 у вигляді двох оперонів (приблизно на відстані 15 kb один від одного), які транскрибувалися в протилежних напрямках (Dennis and Zylstra, 2004). У штамі Pseudomonas putida AK5 некон'югативна плазміда pAK5 кодує фермент, відповідальний за деградацію нафталіну через гентизатний шлях (Izmalkova et al., 2013). У штамі Pseudomonas PMD-1 оперон nah розташований на хромосомі, тоді як оперон sal - на кон'югативній плазміді pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Однак, у Pseudomonas stutzeri AN10 усі гени деградації нафталіну (оперони nah та sal) розташовані на хромосомі та, ймовірно, рекрутуються шляхом транспозиції, рекомбінації та перебудови (Bosch et al., 2000). У Pseudomonas sp. CSV86 оперони nah та sal розташовані в геномі у формі ICE (ICECSV86). Структура захищена tRNAGly, за якою йдуть прямі повтори, що вказують на сайти рекомбінації/приєднання (attR та attL), та фагоподібною інтегразою, розташованою на обох кінцях tRNAGly, таким чином структурно подібною до елемента ICEclc (ICEclcB13 у Pseudomonas knackmusii для деградації хлоркатехолу). Повідомлялося, що гени на ICE можуть бути перенесені шляхом кон'югації з надзвичайно низькою частотою переносу (10-8), тим самим передаючи властивості деградації реципієнту (Basu and Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Більшість генів, відповідальних за деградацію карбарилу, розташовані на плазмідах. Arthrobacter sp. RC100 містить три плазміди (pRC1, pRC2 та pRC300), з яких дві кон'югативні плазміди, pRC1 та pRC2, кодують ферменти, що перетворюють карбарил у гентизат. З іншого боку, ферменти, що беруть участь у перетворенні гентизату на центральні вуглецеві метаболіти, розташовані на хромосомі (Hayaatsu et al., 1999). Бактерії роду Rhizobium. Штам AC100, що використовується для перетворення карбарилу в 1-нафтол, містить плазміду pAC200, яка несе ген cehA, що кодує CH, як частину транспозону Tnceh, оточений послідовностями, подібними до елементів вставки (istA та istB) (Hashimoto et al., 2002). У штамі Sphingomonas CF06 ген деградації карбарилу, як вважається, присутній у п'яти плазмідах: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 та pCF05. Гомологія ДНК цих плазмід є високою, що вказує на існування події дуплікації генів (Feng et al., 1997). У симбіонті, що деградує карбарил, що складається з двох видів Pseudomonas, штам 50581 містить кон'юговану плазміду pCD1 (50 kb), що кодує ген карбарилгідролази mcd, тоді як кон'югована плазміда штаму 50552 кодує фермент, що деградує 1-нафтол (Chapalamadugu and Chaudhry, 1991). У штамі Achromobacter WM111 ген фурадангідролази mcd розташований на плазміді розміром 100 kb (pPDL11). Було показано, що цей ген присутній на різних плазмідах (100, 105, 115 або 124 кб) у різних бактерій з різних географічних регіонів (Parekh et al., 1995). У Pseudomonas sp. C5pp усі гени, відповідальні за деградацію карбарилу, розташовані в геномі, що охоплює послідовність 76,3 кб (Trivedi et al., 2016). Аналіз геному (6,15 Мб) виявив наявність 42 MGE та 36 GEI, з яких 17 MGE були розташовані в суперконтизі A (76,3 кб) із середнім асиметричним вмістом G+C (54–60 мол.%), що свідчить про можливі горизонтальні події переносу генів (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 демонструє подібне розташування генів, що деградують карбарил, але ці гени розташовані на плазміді (Zhu et al., 2019).
Окрім метаболічної ефективності на біохімічному та геномному рівнях, мікроорганізми також демонструють інші властивості або реакції, такі як хемотаксис, властивості модифікації клітинної поверхні, компартменталізація, переважне використання, виробництво біосурфактантів тощо, які допомагають їм ефективніше метаболізувати ароматичні забруднювачі в забрудненому середовищі (Рисунок 7).
Рисунок 7. Різні стратегії клітинної реакції ідеальних бактерій, що розкладають ароматичні вуглеводні, для ефективного біорозкладу сторонніх забруднюючих сполук.
Хемотаксичні реакції вважаються факторами, що посилюють деградацію органічних забруднювачів у гетерогенно забруднених екосистемах. (2002) продемонстрували, що хемотаксис Pseudomonas sp. G7 до нафталіну збільшує швидкість деградації нафталіну у водних системах. Штам дикого типу G7 деградував нафталін набагато швидше, ніж мутантний штам з дефіцитом хемотаксису. Було виявлено, що білок NahY (538 амінокислот з мембранною топологією) котранскрибується з генами шляху метарозщеплення на плазміді NAH7, і, подібно до перетворювачів хемотаксису, цей білок, здається, функціонує як хеморецептор для деградації нафталіну (Grimm and Harwood 1997). Інше дослідження Hansel et al. (2009) показало, що білок є хемотаксичним, але швидкість його деградації висока. (2011) продемонстрували хемотаксичну реакцію Pseudomonas (P. putida) на газоподібний нафталін, де дифузія в газовій фазі призводила до постійного потоку нафталіну до клітин, що контролювало хемотаксичну реакцію клітин. Дослідники використали цю хемотаксичну поведінку для створення мікробів, які б підвищили швидкість деградації. Дослідження показали, що хемосенсорні шляхи також регулюють інші клітинні функції, такі як поділ клітин, регуляція клітинного циклу та формування біоплівки, тим самим допомагаючи контролювати швидкість деградації. Однак використання цієї властивості (хемотаксису) для ефективної деградації ускладнюється кількома вузькими місцями. Основними перешкодами є: (а) різні паралогічні рецептори розпізнають одні й ті ж сполуки/ліганди; (б) існування альтернативних рецепторів, тобто енергетичного тропізму; (в) значні відмінності в послідовностях сенсорних доменів однієї й тієї ж родини рецепторів; та (г) брак інформації про основні бактеріальні сенсорні білки (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Іноді біодеградація ароматичних вуглеводнів утворює кілька метаболітів/проміжних продуктів, які можуть бути хемотаксичними для однієї групи бактерій, але відштовхуючими для інших, що ще більше ускладнює процес. Щоб ідентифікувати взаємодії лігандів (ароматичних вуглеводнів) з хімічними рецепторами, ми сконструювали гібридні сенсорні білки (PcaY, McfR та NahY) шляхом об'єднання сенсорних та сигнальних доменів Pseudomonas putida та Escherichia coli, які націлені на рецептори ароматичних кислот, проміжних продуктів TCA та нафталіну відповідно (Luu et al., 2019).
Під впливом нафталіну та інших поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАВ) структура бактеріальної мембрани та цілісність мікроорганізмів зазнають значних змін. Дослідження показали, що нафталін перешкоджає взаємодії ацильного ланцюга через гідрофобні взаємодії, тим самим збільшуючи набухання та плинність мембрани (Sikkema et al., 1995). Щоб протидіяти цьому шкідливому впливу, бактерії регулюють плинність мембрани, змінюючи співвідношення та склад жирних кислот між ізо/антеізо розгалуженими жирними кислотами та ізомеризуючи цис-ненасичені жирні кислоти у відповідні транс-ізомери (Heipieper and de Bont, 1994). У Pseudomonas stutzeri, вирощеної після обробки нафталіном, співвідношення насичених та ненасичених жирних кислот збільшилося з 1,1 до 2,1, тоді як у Pseudomonas JS150 це співвідношення збільшилося з 7,5 до 12,0 (Mrozik et al., 2004). При вирощуванні на нафталіні клітини Achromobacter KAs 3–5 демонстрували агрегацію клітин навколо кристалів нафталіну та зменшення заряду поверхні клітин (з -22,5 до -2,5 мВ), що супроводжувалося цитоплазматичною конденсацією та вакуолізацією, що свідчить про зміни в структурі клітин та властивостях поверхні клітин (Mohapatra et al., 2019). Хоча клітинні/поверхневі зміни безпосередньо пов'язані з кращим поглинанням ароматичних забруднювачів, відповідні стратегії біоінженерії не були ретельно оптимізовані. Маніпуляції формою клітин рідко використовувалися для оптимізації біологічних процесів (Volke and Nikel, 2018). Делеція генів, що впливають на поділ клітин, викликає зміни в морфології клітин. Делеція генів, що впливають на поділ клітин, викликає зміни в морфології клітин. У Bacillus subtilis було показано, що білок клітинної перегородки SepF бере участь у формуванні перегородки та необхідний для наступних етапів поділу клітин, але він не є необхідним геном. Делеція генів, що кодують пептидглікангідролази у Bacillus subtilis, призвела до подовження клітин, збільшення питомої швидкості росту та покращення продуктивності ферментів (Cui et al., 2018).
Для досягнення ефективної деградації штамів Pseudomonas C5pp та C7 було запропоновано компартментацію шляху деградації карбарилу (Kamini et al., 2018). Припускається, що карбарил транспортується в периплазматичний простір через перегородку зовнішньої мембрани та/або через дифузійні порини. CH – це периплазматичний фермент, який каталізує гідроліз карбарилу до 1-нафтолу, який є більш стабільним, більш гідрофобним та більш токсичним. CH локалізований у периплазмі та має низьку спорідненість до карбарилу, таким чином контролюючи утворення 1-нафтолу, запобігаючи його накопиченню в клітинах та зменшуючи його токсичність для клітин (Kamini et al., 2018). Отриманий 1-нафтол транспортується в цитоплазму через внутрішню мембрану шляхом розділення та/або дифузії, а потім гідроксилюється до 1,2-дигідроксинафталіну високоафінним ферментом 1NH для подальшого метаболізму в центральному вуглецевому шляху.
Хоча мікроорганізми мають генетичні та метаболічні можливості для розкладання ксенобіотичних джерел вуглецю, ієрархічна структура їх використання (тобто переважне використання простих над складними джерелами вуглецю) є основною перешкодою для біодеградації. Наявність та використання простих джерел вуглецю знижує регуляцію генів, що кодують ферменти, що розкладають складні/небажані джерела вуглецю, такі як поліароматичні ароматизатори (ПАВ). Добре вивченим прикладом є те, що коли глюкоза та лактоза одночасно подаються до Escherichia coli, глюкоза використовується ефективніше, ніж лактоза (Jacob and Monod, 1965). Повідомлялося, що Pseudomonas розкладає різноманітні ПАВ та ксенобіотичні сполуки як джерела вуглецю. Ієрархія використання джерел вуглецю у Pseudomonas така: органічні кислоти > глюкоза > ароматичні сполуки (Hylemon and Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Однак є виняток. Цікаво, що Pseudomonas sp. CSV86 демонструє унікальну ієрархічну структуру, яка переважно використовує ароматичні вуглеводні (бензойну кислоту, нафталін тощо), а не глюкозу, та кометаболізує ароматичні вуглеводні з органічними кислотами (Basu et al., 2006). У цієї бактерії гени деградації та транспорту ароматичних вуглеводнів не пригнічуються навіть за наявності другого джерела вуглецю, такого як глюкоза або органічні кислоти. При вирощуванні в середовищі з глюкозою та ароматичними вуглеводнями було відзначено, що гени транспорту та метаболізму глюкози були пригнічені, ароматичні вуглеводні використовувалися в першій логарифмічній фазі, а глюкоза - у другій логарифмічній фазі (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). З іншого боку, присутність органічних кислот не впливала на експресію метаболізму ароматичних вуглеводнів, тому очікується, що ця бактерія буде штамом-кандидатом для досліджень біодеградації (Phale et al., 2020).
Загальновідомо, що біотрансформація вуглеводнів може спричинити оксидативний стрес та підвищення регуляції антиоксидантних ферментів у мікроорганізмів. Неефективна біодеградація нафталіну як у клітинах стаціонарної фази, так і за наявності токсичних сполук призводить до утворення активних форм кисню (АФК) (Kang et al. 2006). Оскільки ферменти, що деградують нафталін, містять залізо-сірчані кластери, під впливом оксидативного стресу залізо в гемових та залізо-сірчаних білках буде окислюватися, що призведе до інактивації білка. Фередоксин-НАДФ+-редуктаза (Fpr) разом із супероксиддисмутазою (СОД) опосередковує оборотну окисно-відновну реакцію між НАДФ+/НАДФН та двома молекулами фередоксину або флаводоксину, тим самим поглинаючи АФК та ​​відновлюючи залізо-сірчаний центр під впливом оксидативного стресу (Li et al. 2006). Повідомлялося, що як Fpr, так і SodA (SOD) у Pseudomonas можуть бути індуковані оксидативним стресом, а підвищена активність SOD та каталази спостерігалася у чотирьох штамах Pseudomonas (O1, W1, As1 та G1) під час росту в умовах додавання нафталіну (Kang et al., 2006). Дослідження показали, що додавання антиоксидантів, таких як аскорбінова кислота або двовалентне залізо (Fe2+), може збільшити швидкість росту нафталіну. Коли Rhodococcus erythropolis ріс у нафталіновому середовищі, транскрипція генів цитохрому P450, пов'язаних з оксидативним стресом, включаючи sodA (Fe/Mn супероксиддисмутаза), sodC (Cu/Zn супероксиддисмутаза) та recA, збільшувалася (Sazykin et al., 2019). Порівняльний кількісний протеомний аналіз клітин Pseudomonas, культивованих у нафталіні, показав, що підвищення регуляції різних білків, пов'язаних з реакцією на оксидативний стрес, є стратегією подолання стресу (Herbst et al., 2013).
Повідомлялося, що мікроорганізми виробляють біосурфактанти під дією гідрофобних джерел вуглецю. Ці поверхнево-активні речовини є амфіфільними поверхнево-активними сполуками, які можуть утворювати агрегати на межі розділу олія-вода або повітря-вода. Це сприяє псевдосолюбілізації та полегшує адсорбцію ароматичних вуглеводнів, що призводить до ефективного біодеградації (Rahman et al., 2002). Завдяки цим властивостям біосурфактанти широко використовуються в різних галузях промисловості. Додавання хімічних поверхнево-активних речовин або біосурфактантів до бактеріальних культур може підвищити ефективність та швидкість деградації вуглеводнів. Серед біосурфактантів рамноліпіди, що продукуються Pseudomonas aeruginosa, були широко вивчені та охарактеризовані (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Крім того, інші типи біоповерхнево-активних речовин включають ліпопептиди (муцини з Pseudomonas fluorescens), емульгатор 378 (з Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg and Ron, 1999), ліпіди трегалозидисахариду з Rhodococcus (Ramdahl, 1985), ліхенін з Bacillus (Saraswathy and Hallberg, 2002) та поверхнево-активні речовини з Bacillus subtilis (Siegmund and Wagner, 1991) та Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Було показано, що ці потужні поверхнево-активні речовини знижують поверхневий натяг з 72 дин/см до менш ніж 30 дин/см, що забезпечує краще поглинання вуглеводнів. Повідомлялося, що Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia та інші види бактерій можуть продукувати різні біосурфактанти на основі рамноліпідів та гліколіпідів при вирощуванні в середовищах з нафталіном та метилнафталіном (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 може продукувати позаклітинний біосурфактант Biosur-Pm при вирощуванні на ароматичних сполуках, таких як нафтойна кислота (Phale et al., 1995). Кінетика утворення Biosur-Pm показала, що його синтез є процесом, залежним від росту та pH. Було виявлено, що кількість Biosur-Pm, що продукується клітинами при нейтральному pH, була вищою, ніж при pH 8,5. Клітини, вирощені при pH 8,5, були більш гідрофобними та мали вищу спорідненість до ароматичних та аліфатичних сполук, ніж клітини, вирощені при pH 7,0. У Rhodococcus spp. N6, вище співвідношення вуглецю до азоту (C:N) та обмеження заліза є оптимальними умовами для виробництва позаклітинних біосурфактантів (Mutalik et al., 2008). Були зроблені спроби покращити біосинтез біосурфактантів (сурфактинів) шляхом оптимізації штамів та ферментації. Однак титр сурфактанту в культуральному середовищі низький (1,0 г/л), що створює труднощі для великомасштабного виробництва (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Тому для покращення його біосинтезу використовувалися методи генної інженерії. Однак його інженерна модифікація є складною через великий розмір оперона (∼25 kb) та складну біосинтетичну регуляцію системи кворум-сенсорів (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). У бактеріях Bacillus було проведено низку генно-інженерних модифікацій, головним чином спрямованих на збільшення продукції сурфактину шляхом заміни промотора (оперону srfA), надмірної експресії білка експорту сурфактину YerP та регуляторних факторів ComX та PhrC (Jiao et al., 2017). Однак ці методи генної інженерії досягли лише однієї або кількох генетичних модифікацій і ще не досягли комерційного виробництва. Тому необхідне подальше вивчення методів оптимізації на основі знань.
Дослідження біодеградації поліацетатних ароматичних речовин (ПАВ) переважно проводяться у стандартних лабораторних умовах. Однак, на забруднених ділянках або в забрудненому середовищі, було показано, що багато абіотичних та біотичних факторів (температура, pH, кисень, доступність поживних речовин, біодоступність субстрату, інші ксенобіотики, інгібування кінцевих продуктів тощо) змінюють та впливають на деградаційну здатність мікроорганізмів.
Температура має значний вплив на біодеградацію ПАВ. Зі збільшенням температури концентрація розчиненого кисню зменшується, що впливає на метаболізм аеробних мікроорганізмів, оскільки їм потрібен молекулярний кисень як один із субстратів для оксигеназ, що здійснюють реакції гідроксилювання або розриву кільця. Часто зазначається, що підвищена температура перетворює вихідні ПАВ на більш токсичні сполуки, тим самим пригнічуючи біодеградацію (Muller et al., 1998).
Було зазначено, що багато ділянок, забруднених поліацетатними вуглеводнями (ПАВ), мають екстремальні значення pH, такі як ділянки, забруднені кислотними шахтними стоками (pH 1–4), та ділянки газифікації природного газу/вугілля, забруднені лужним фільтратом (pH 8–12). Ці умови можуть серйозно вплинути на процес біорозкладу. Тому перед використанням мікроорганізмів для біоремедіації рекомендується відрегулювати pH, додаючи відповідні хімічні речовини (з помірним або дуже низьким окисно-відновним потенціалом), такі як сульфат амонію або аміачна селітра для лужних ґрунтів або вапнування карбонатом кальцію або карбонатом магнію для кислих ділянок (Bowlen et al. 1995; Gupta and Sar 2020).
Надходження кисню до ураженої ділянки є фактором, що обмежує швидкість біодеградації поліацетатних ароматичних вуглеводнів (ПАВ). Через окисно-відновні умови навколишнього середовища, процеси біоремедіації in situ зазвичай вимагають надходження кисню із зовнішніх джерел (обробка ґрунту, барботаж повітрям та додавання хімікатів) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) продемонстрували, що додавання пероксиду магнію (сполуки, що вивільняє кисень) до забрудненого водоносного горизонту може ефективно біоремедіювати сполуки BTEX. В іншому дослідженні досліджували деградацію фенолу та BTEX in situ у забрудненому водоносному горизонті шляхом введення нітрату натрію та будівництва екстракційних свердловин для досягнення ефективної біоремедіації (Bewley and Webb, 2001).