Наразі *Поточна адреса: Кельн 50931, Німеччина, Кельнський кластер передового досвіду, дослідження клітинної стресової реакції при захворюваннях, пов'язаних зі старінням (CECAD).
Нейродегенерацію мітохондріальних захворювань вважають незворотною, оскільки метаболічна пластичність нейронів обмежена, але вплив мітохондріальної дисфункції на автономність клітин нейронального метаболізму в організмі погано вивчений. Тут ми представляємо клітинно-специфічний протеом нейронів Пуркіньє з прогресуючим дефіцитом OXPHOS, спричиненим порушенням динаміки мітохондріального злиття. Ми виявили, що мітохондріальна дисфункція спровокувала глибокі зміни в галузі протеоміки, що зрештою призвело до послідовної активації точних метаболічних програм перед загибеллю клітин. Несподівано ми визначили очевидну індукцію піруваткарбоксилази (PCx) та інших ферментів проти старіння, які доповнюють проміжні продукти циклу TCA. Інгібування PCx посилило оксидативний стрес та нейродегенерацію, що вказує на те, що атеросклероз має захисний ефект у нейронах, яким бракує OXPHOS. Відновлення мітохондріального злиття в термінально дегенерованих нейронах повністю змінює ці метаболічні характеристики, тим самим запобігаючи загибелі клітин. Наші результати ідентифікують раніше невідомі шляхи, які надають стійкості мітохондріальній дисфункції, та показують, що нейродегенерацію можна звернути навіть на пізніх стадіях захворювання.
Центральна роль мітохондрій у підтримці енергетичного метаболізму нейронів підкреслюється широкими неврологічними симптомами, пов'язаними з мітохондріальними захворюваннями людини. Більшість цих захворювань спричинені генними мутаціями, які регулюють експресію мітохондріальних генів (1, 2) або руйнуванням генів, пов'язаним з динамікою мітохондрій, що опосередковано впливає на стабільність мітохондріальної ДНК (мтДНК) (3, 4). Робота на тваринних моделях показала, що у відповідь на мітохондріальну дисфункцію в навколишніх тканинах можуть активуватися консервативні метаболічні шляхи (5-7), що надає важливу інформацію для глибокого розуміння патогенезу цих складних захворювань. На противагу цьому, наше розуміння метаболічних змін певних типів клітин, спричинених загальним збоєм у виробленні мітохондріального аденозинтрифосфату (АТФ) мозком, є фундаментальним (8), що підкреслює необхідність визначення терапевтичних мішеней, які можна використовувати для запобігання або профілактики захворювань. Запобігання нейродегенерації (9). Брак інформації полягає в тому, що нервові клітини широко вважаються такими, що мають дуже обмежену метаболічну гнучкість порівняно з типами клітин навколишніх тканин (10). З огляду на те, що ці клітини відіграють центральну роль у координації постачання метаболітів до нейронів для сприяння синаптичній передачі та реагування на пошкодження та захворювання, здатність адаптувати клітинний метаболізм до складних умов тканини мозку майже обмежується гліальними клітинами (11-14). Крім того, властива клітинна гетерогенність тканини мозку значною мірою перешкоджає вивченню метаболічних змін, що відбуваються в певних нейрональних підгрупах. Як наслідок, мало що відомо про точні клітинні та метаболічні наслідки мітохондріальної дисфункції в нейронах.
Щоб зрозуміти метаболічні наслідки мітохондріальної дисфункції, ми виділили нейрони Пуркіньє (ПН) на різних стадіях нейродегенерації, спричиненої руйнуванням злиття зовнішньої мембрани мітохондрій (Mfn2). Хоча мутації Mfn2 у людей пов'язані з формою спадкової моторно-сенсорної нейропатії, відомої як синдром Шарко-Марі-Тута типу 2A (15), умовне руйнування Mfn2 у мишей є добре відомим методом індукції дисфункції окислювально-фосфорилювання (OXPHOS). Різні нейрональні підтипи (16-19) та результуючий нейродегенеративний фенотип супроводжуються прогресуючими неврологічними симптомами, такими як рухові розлади (18, 19) або мозочкова атаксія (16). Використовуючи комбінацію кількісної (LFQ) протеоміки без міток, метаболоміки, візуалізації та вірусологічних методів, ми показуємо, що прогресуюча нейродегенерація сильно індукує піруваткарбоксилазу (PCx) та інші фактори, що беруть участь в артеріосклерозі ПН in vivo. Експресія ферментів. Щоб перевірити актуальність цього відкриття, ми спеціально знизили експресію PCx у нейронах з дефіцитом Mfn2 та виявили, що ця операція посилила оксидативний стрес та прискорила нейродегенерацію, тим самим доводячи, що азооспермія забезпечує метаболічну адаптацію до загибелі клітин. Значна експресія MFN2 може повністю відновити нейрональні нейрони з термінальною дегенерацією, важким дефіцитом OXPHOS, масивним споживанням мітохондріальної ДНК та, очевидно, порушеною мітохондріальною мережею, що ще раз підкреслює, що ця форма нейродегенерації може відновитися навіть на пізній стадії захворювання до загибелі клітин.
Для візуалізації мітохондрій у нейронах з нокаутом Mfn2 ми використали штам мишей, який дозволяє Cre-залежним мітохондріям впливати на експресію жовтого флуоресцентного білка (YFP) (mtYFP) (20) Cre та перевірили морфологію мітохондрій in vivo. Ми виявили, що руйнування гена Mfn2 у нейронах призводить до поступового поділу мітохондріальної мережі (Рисунок S1A), і найперша зміна була виявлена ​​у віці 3 тижнів. Навпаки, суттєва дегенерація клітинного шару нейронів, про що свідчить втрата імунофарбування кальбіндином, почалася лише у віці 12 тижнів (Рисунок 1, A та B). Невідповідність часу між найпершими змінами морфології мітохондрій та видимим початком загибелі нейронів спонукала нас дослідити метаболічні зміни, викликані мітохондріальною дисфункцією до загибелі клітин. Ми розробили стратегію на основі сортування клітин, активованого флуоресценцією (FACS), для виділення PN, що експресують YFP (YFP+) (Рисунок 1C), а також у контрольних мишей (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: :L7-cre), далі CTRL (Рисунок S1B). Оптимізація стратегії стробування на основі відносної інтенсивності сигналу YFP дозволяє нам очистити тіло YFP+ (YFPhigh) PN від не-PN (YFPneg) (Рисунок S1B) або передбачуваних флуоресцентних аксонових/дендритних фрагментів (YFPlow; Рисунок S1D, ліворуч), що підтверджено конфокальним мікроскопом (Рисунок S1D, праворуч). Щоб перевірити ідентичність класифікованої популяції, ми провели LFQ-протеоміку, а потім аналіз головних компонентів і виявили, що існує чітке розділення між клітинами YFPhigh та YFPneg (Рисунок S1C). Клітини YFPhigh показали чисте збагачення відомими маркерами полінейронних нейронів (тобто Calb1, Pcp2, Grid2 та Itpr3) (21, 22), але не збагачення білками, які зазвичай експресуються в нейронах або інших типах клітин (Рисунок 1D). Порівняння зразків у класифікованих клітинах YFPhigh, зібраних у незалежних експериментах, показало коефіцієнт кореляції > 0,9, що демонструє хорошу відтворюваність між біологічними повторностями (Рисунок S1E). Таким чином, ці дані підтвердили наш план гострої та специфічної ізоляції можливих полінейронних нейронів. Оскільки використана драйверна система L7-cre індукує мозаїчну рекомбінацію в перший тиждень після доставки (23), ми почали вибраковувати мишей з CTRL та умовно (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) збирати нейрони. Після завершення рекомбінації це називається Mfn2cKO у віці 4 тижнів. Як кінцеву точку ми обрали 8-тижневий вік, коли шар PN був інтактним, незважаючи на очевидну фрагментацію мітохондрій (Рисунок 1B та Рисунок S1A). Загалом ми кількісно визначили 3013 білків, з яких близько 22% базувалися на анотаціях MitoCarta 2.0 на основі мітохондріального протеому як мітохондрій (Рисунок 1E) (Рисунок 1E) (24). Аналіз диференціальної експресії генів, проведений на 8-му тижні, показав, що лише 10,5% усіх білків мали суттєві зміни (Рисунок 1F та Рисунок S1F), з яких 195 білків були зниженої регуляції, а 120 білків - підвищеної (Рисунок 1F). Варто зазначити, що «інноваційний аналіз шляхів» цього набору даних показує, що диференційно експресовані гени переважно належать до обмеженого набору специфічних метаболічних шляхів (Рисунок 1G). Цікаво, що хоча зниження регуляції шляхів, пов'язаних з OXPHOS та кальцієвою сигналізацією, підтверджує індукцію мітохондріальної дисфункції в нейронних нейронах з дефіцитом злиття, інші категорії, які в основному пов'язані з метаболізмом амінокислот, значно підвищуються, що відповідає метаболізму, який відбувається в мітохондріальних нейронах. Перепрограмування є послідовним. дисфункція.
(A) Репрезентативні конфокальні фотографії зрізів мозочка мишей CTRL та Mfn2cKO, що демонструють прогресуючу втрату поліморфізмів (кальбіндин, сірий); ядра були контрастно забарвлені DAPI. (B) Кількісна оцінка (A) (однофакторний дисперсійний аналіз, ***P<0,001; n = від 4 до 6 кіл від трьох мишей). (C) Експериментальний робочий процес. (D) Розподіл маркерів, специфічних для Пуркіньє (зверху) та інших типів клітин (посередині), на тепловій карті. (E) Діаграма Венна, що показує кількість мітохондріальних білків, ідентифікованих у класифікованому поліморфізмі. (F) Вулканічна діаграма диференційно експресованих білків у нейронах Mfn2cKO через 8 тижнів (граничне значення значущості 1,3). (G) Аналіз шляхів креативності показує п'ять найважливіших шляхів підвищення регуляції (червоний) та зниження регуляції (синій) у поліморфізмі Mfn2cKO, класифікованому як 8 тижнів. Показано середній рівень експресії кожного виявленого білка. Теплова карта у градаціях сірого: скориговане значення P. ns, неважливо.
Дані протеоміки показали, що експресія білків комплексів I, III та IV поступово знижувалася. Комплекси I, III та IV містили основні субодиниці, кодовані мтДНК, тоді як комплекс II, який був кодований лише ядерно, практично не змінився (Рисунок 2A та Рисунок S2A). Відповідно до результатів протеоміки, імуногістохімія зрізів тканини мозочка показала, що рівень субодиниці MTCO1 (субодиниця 1 мітохондріальної цитохром С оксидази) комплексу IV у периферичній нервовій системі (ПН) поступово знижувався (Рисунок 2B). Субодиниця Mtatp8, кодована мтДНК, була значно знижена (Рисунок S2A), тоді як стаціонарний рівень субодиниці АТФ-синтази, кодованої ядерно, залишався незмінним, що узгоджується з відомим стабільним комплексом підзбірки АТФ-синтази F1, коли експресія мтДНК стабільна. Утворення є послідовним. Переривання (7). Оцінка рівня мтДНК у відсортованих ПН Mfn2cKO за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (кПЛР) підтвердила поступове зменшення кількості копій мтДНК. Порівняно з контрольною групою, у віці 8 тижнів збереглося лише близько 20% рівня мтДНК (Рисунок 2C). Відповідно до цих результатів, для виявлення ДНК було використано конфокальний мікроскопічний аналіз нейронів Mfn2cKO, який показує залежне від часу споживання мітохондріальних нуклеотидів (Рисунок 2D). Ми виявили, що лише деякі кандидати, залучені до деградації мітохондріальних білків та стресової реакції, були підвищені, включаючи Lonp1, Afg3l2 та Clpx, а також фактори збірки комплексу OXPHOS. Не було виявлено суттєвих змін у рівнях білків, залучених до апоптозу (Рисунок S2B). Аналогічно, ми виявили, що канали мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму, залучені до транспорту кальцію, зазнали лише незначних змін (Рисунок S2C). Крім того, оцінка білків, пов'язаних з аутофагією, не виявила суттєвих змін, що узгоджується з видимою індукцією аутофагосом, що спостерігається in vivo за допомогою імуногістохімії та електронної мікроскопії (Рисунок S3). Однак прогресуюча дисфункція OXPHOS у нейронах супроводжується очевидними ультраструктурними змінами мітохондрій. Мітохондріальні кластери можна побачити в тілах клітин та дендритних деревах нейронів Mfn2cKO віком 5 та 8 тижнів, а структура внутрішньої мембрани зазнала суттєвих змін (рисунки S4, A та B). Відповідно до цих ультраструктурних змін та значного зменшення мтДНК, аналіз гострих зрізів мозочка головного мозку за допомогою метилового естеру тетраметилродаміну (TMRM) показав, що потенціал мітохондріальної мембрани в нейронах Mfn2cKO був значно знижений (рисунок S4C).
(A) Аналіз залежності рівня експресії комплексу OXPHOS від часу. Розглядайте лише білки з P<0,05 через 8 тижнів (двофакторний дисперсійний аналіз). Пунктирна лінія: Без коригування порівняно з CTRL. (B) Ліворуч: Приклад зрізу мозочка, міченого антитілом проти MTCO1 (масштабна шкала, 20 мкм). Площа, зайнята тільцями клітин Пуркіньє, покрита жовтим кольором. Праворуч: Кількісне визначення рівнів MTCO1 (однофакторний дисперсійний аналіз; n = від 7 до 20 клітин, проаналізованих від трьох мишей). (C) ПЛР-аналіз кількості копій мтДНК у відсортованій PN (однофакторний дисперсійний аналіз; n = від 3 до 7 мишей). (D) Ліворуч: Приклад зрізу мозочка, міченого антитілом проти ДНК (масштабна шкала, 20 мкм). Площа, зайнята тільцями клітин Пуркіньє, покрита жовтим кольором. Праворуч: Кількісне визначення уражень мтДНК (однофакторний дисперсійний аналіз; n = від 5 до 9 клітин від трьох мишей). (E) Приклад гострого зрізу мозочка, що показує mitoYFP + клітини Пуркіньє (стрілка) на записі з використанням методу клампування цілих клітин. (F) Кількісна оцінка кривої IV. (G) Типові записи ін'єкції деполяризуючого струму в клітини Пуркіньє CTRL та Mfn2cKO. Верхня крива: перший імпульс, який запустив AP. Нижня крива: максимальна частота AP. (H) Кількісна оцінка постсинаптичних спонтанних входів (sPSP). Типова крива запису та її коефіцієнт масштабування показані на (I). Однофакторний дисперсійний аналіз проаналізував n = 5-20 клітин від трьох мишей. Дані виражені як середнє ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Типові кривини спонтанної AP, записаної за допомогою режиму перфорованого клампування. Верхня крива: максимальна частота AP. Нижня крива: масштабування однієї AP. (K) Кількісно визначте середню та максимальну частоту AP згідно з (J). Критерій Манна-Вітні; n = 5 клітин було проаналізовано від чотирьох мишей. Дані виражені як середнє значення ± SEM; це не важливо.
Очевидне пошкодження OXPHOS було виявлено у 8-тижневих Mfn2cKO PN, що свідчить про серйозні порушення фізіологічної функції нейронів. Тому ми проаналізували пасивні електричні характеристики нейронів з дефіцитом OXPHOS через 4-5 тижнів та 7-8 тижнів, виконавши запис цілих клітин за допомогою патч-клемп у гострих зрізах мозочка (Рисунок 2E). Несподівано, середній мембранний потенціал спокою та вхідний опір нейронів Mfn2cKO були подібними до контролю, хоча між клітинами були незначні відмінності (Таблиця 1). Аналогічно, у віці 4-5 тижнів не було виявлено суттєвих змін у залежності струм-ампера (IV крива) (Рисунок 2F). Однак жоден нейрон Mfn2cKO віком 7-8 тижнів не пережив режим внутрішньовенного введення (етап гіперполяризації), що свідчить про чітку чутливість до потенціалу гіперполяризації на цій пізній стадії. На відміну від цього, у нейронах Mfn2cKO деполяризуючі струми, що викликають повторювані розряди потенціалу дії (ПД), добре переносяться, що вказує на те, що їхні загальні моделі розрядів суттєво не відрізняються від моделей 8-тижневих контрольних нейронів (Таблиця 1 та Рисунок 2G). Аналогічно, частота та амплітуда спонтанних постсинаптичних струмів (сПСС) були порівнянні з контрольною групою, а частота подій збільшилася з 4 тижнів до 5 тижнів, потім з 7 тижнів до 8 тижнів з подібним збільшенням (Рисунок 2, H та I). Період синаптичного дозрівання в ПН (25). Подібні результати були отримані після перфорованих ПН-латок. Така конфігурація запобігає можливій компенсації дефектів клітинного АТФ, як це може статися при записі з використанням клемп-латок цілих клітин. Зокрема, потенціал мембрани спокою та частота спонтанного спрацьовування нейронів Mfn2cKO не зазнали змін (Рисунок 2, J та K). Підсумовуючи, ці результати показують, що нейронні нейрони з очевидною дисфункцією OXPHOS можуть добре справлятися з високочастотними моделями розрядів, що вказує на існування механізму компенсації, який дозволяє їм підтримувати майже нормальні електрофізіологічні реакції.
Дані виражені як середнє значення ± SEM (однофакторний дисперсійний аналіз, тест множинних порівнянь Холма-Сідака; *P<0,05). Номер одиниці позначено в дужках.
Ми поставили собі за мету дослідити, чи якась категорія в наборі даних протеоміки (Рисунок 1G) містить шляхи, які можуть протидіяти тяжкому дефіциту OXPHOS, тим самим пояснюючи, чому уражена периферична нервова система може підтримувати майже нормальну електрофізіологію (Рисунок 2, E-K). Протеомний аналіз показав, що ферменти, що беруть участь у катаболізмі амінокислот з розгалуженим ланцюгом (BCAA), були значно підвищені (Рисунок 3A та Рисунок S5A), а кінцевий продукт ацетил-КоА (CoA) або сукциніл-КоА може доповнювати трикарбоксилати в циклі артеріосклерозу (TCA). Ми виявили, що вміст трансамінази 1 (BCAT1) та BCAT2 BCAA збільшився. Вони каталізують перший етап катаболізму BCAA шляхом генерації глутамату з α-кетоглутарату (26). Усі субодиниці, що утворюють комплекс кетокислот дегідрогенази з розгалуженим ланцюгом (BCKD), підвищено регулюються (комплекс каталізує подальше та незворотне декарбоксилювання отриманого вуглецевого скелета BCAA) (Рисунок 3A та Рисунок S5A). Однак, жодних очевидних змін у самих BCAA у відсортованих полінейронних сечах не було виявлено, що може бути пов'язано зі збільшенням клітинного поглинання цих незамінних амінокислот або використанням інших джерел (глюкози або молочної кислоти) для доповнення циклу TCA (Рисунок S5B). Полінейронні сеча, яким бракувало OXPHOS, також демонстрували підвищену активність розкладання та трансамінування глутаміну у 8-тижневому віці, що може бути відображено підвищенням регуляції мітохондріальних ферментів глутамінази (GLS) та глутамінпіруваттрансамінази 2 (GPT2) (Рисунок 3, A та C). Варто зазначити, що підвищення регуляції GLS обмежується сплайсовою ізоформою глутамінази C (GLS-GAC) (зміна Mfn2cKO/CTRL приблизно в 4,5 раза, P = 0,05), а її специфічна підвищена регуляція в ракових тканинах може підтримувати мітохондріальну біоенергію. (27).
(A) Теплова карта показує кратність зміни рівня білка для зазначеного шляху через 8 тижнів. (B) Приклад зрізу мозочка, міченого антитілом проти PCx (масштабна шкала, 20 мкм). Жовта стрілка вказує на тіло клітин Пуркіньє. (C) Аналіз експресії білка з часом, ідентифікованого як важливого кандидата для атеросклерозу (множинний t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 мишей). (D) Вище: Схематична діаграма, що показує різні способи надходження міченого вуглецю, що міститься в індикаторі [1-13C]пірувату (тобто через PDH або трансартеріальний шлях). Внизу: Скрипкова діаграма показує відсоток одноразово міченого вуглецю (M1), перетвореного на аспарагінову кислоту, лимонну кислоту та яблучну кислоту після мічення гострих зрізів мозочка [1-13C]піруватом (парний t-тест; ** P <0,01). (E) Комплексний аналіз часових історій зазначеного шляху. Розглядайте лише білки з P <0,05 через 8 тижнів. Пунктирна лінія: немає значення коригування (двофакторний дисперсійний аналіз; * P <0,05; *** P <0,001). Дані виражені як середнє значення ± SEM.
У нашому аналізі катаболізм BCAA став одним із ключових шляхів підвищення регуляції. Цей факт переконливо свідчить про те, що об'єм вентиляції, що входить у цикл TCA, може змінюватися при периферичних нейронах з дефіцитом OXPHOS. Це може являти собою основну форму нейрональної метаболічної перебудови, яка може мати прямий вплив на фізіологію нейронів та виживання під час підтримки тяжкої дисфункції OXPHOS. Відповідно до цієї гіпотези, ми виявили, що основний антиатеросклеротичний фермент PCx регулюється підвищено (Mfn2cKO/CTRL змінюється приблизно в 1,5 рази; Рисунок 3A), що каталізує перетворення пірувату в оксалоацетат (28), який, як вважається, знаходиться в тканині мозку. Експресія обмежується астроцитами (29, 30). Відповідно до результатів протеоміки, конфокальна мікроскопія показала, що експресія PCx була специфічно та значно підвищена в периферичних нейронах з дефіцитом OXPHOS, тоді як реактивність PCx була переважно обмежена сусідніми гліальними клітинами Бергмана контрольної групи (Рисунок 3B). Для функціональної перевірки спостережуваної підвищеної регуляції PCx ми обробили гострі зрізи мозочка трассером [1-13C]піруват. Коли піруват окислювався піруватдегідрогеназою (PDH), його ізотопна мітка зникала, але вбудовується в проміжні продукти циклу TCA, коли піруват метаболізується судинними реакціями (Рисунок 3D). На підтвердження наших протеомних даних ми спостерігали велику кількість маркерів цього трасера ​​в аспарагіновій кислоті зрізів Mfn2cKO, тоді як лимонна та яблучна кислоти також мали помірну тенденцію, хоча й незначну (Рисунок 3D).
У дофамінових нейронах мишей MitoPark з мітохондріальною дисфункцією, спричиненою дофаміновими нейронами, які специфічно руйнують ген мітохондріального транскрипційного фактора А (Tfam) (Рисунок S6B), експресія PCx також була значно підвищена (31), що вказує на ацетонокислий артеріосклероз. Виникнення захворювання регулюється під час дисфункції нейронального OXPHOS в організмі. Варто зазначити, що було виявлено, що унікальні ферменти (32-34), які можуть експресуватися в нейронах, що можуть бути пов'язані з артеріосклерозом, значно підвищені в нейронах, яким бракує OXPHOS, такі як пропіоніл-КоА-карбоксилаза (PCC-A), малоніл-КоА перетворює пропіоніл-КоА на сукциніл-КоА, та мітохондріальний яблучний фермент 3 (ME3), основна роль якого полягає у відновленні пірувату з малату (Рисунок 3, A та C) (33, 35). Крім того, ми виявили значне збільшення ферменту Pdk3, який фосфорилює і таким чином інактивує PDH (36), тоді як жодних змін у ферменті Pdp1, який активує PDH, або в самому ферментному комплексі PDH не виявлено (Рисунок 3A). Відповідно, у нейрональних нейронах Mern2cKO фосфорилювання субодиниці α1 (PDHE1α) компонента піруватдегідрогенази E1 комплексу PDH у Ser293 (відомому тим, що він пригнічує ферментативну активність PDH) було посилено (Рисунок S6C) (Рисунок S6C). Піруват не має судинного доступу.
Зрештою, ми виявили, що супершлях біосинтезу серину та гліцину, пов'язаний з ним мітохондріальний фолатний (1C) цикл та біосинтез проліну (Рисунок 1G та Рисунок S5C) значно підвищуються, згідно з повідомленнями, під час процесу активації. Навколишні тканини активуються з мітохондріальною дисфункцією (5-7). Конфокальний аналіз, що підтверджує ці протеомні дані, показав, що при PN з відсутнім OXPHOS, зрізи мозочка 8-тижневих мишей піддавалися дії серинової гідроксиметилтрансферази 2 (SHMT2), ключового ферменту мітохондріального фолатного циклу. Значна імунна відповідь (Рисунок S5D). У 13 гострих зрізах мозочка, інкубованих з CU-глюкозою, експерименти з метаболічного відстеження додатково підтвердили підвищену регуляцію біосинтезу серину та проліну, що вказує на збільшення потоку ізоформ вуглецю в серин та пролін (Рисунок S5E). Оскільки реакції, що стимулюються GLS та GPT2, відповідають за синтез глутамату з глутаміну та трансамінування між глутаматом та α-кетоглутаратом, їх підвищена регуляція вказує на те, що нейрони з дефіцитом OXPHOS мають підвищену потребу в глутамті. Це може бути спрямоване на підтримку підвищеного біосинтезу проліну (рис. S5C). На відміну від цих змін, протеомний аналіз астроцитів мозочка специфічних для PN мишей Mfn2cKO показав, що ці шляхи (включаючи всі антипероксидази) суттєво не змінилися в експресії, що демонструє, що це метаболічне перенаправлення є селективним до деградованого PN (рис. S6, D-G).
Підсумовуючи, ці аналізи виявили суттєво різні закономірності часової активації специфічних метаболічних шляхів у нейрональних нейронах. Хоча аномальна функція мітохондрій нейронів може призвести до раннього атеросклерозу та ремоделювання 1C (рис. 3E та рис. S5C), і навіть до передбачуваних змін в експресії I та IV комплексів, зміни в синтезі серину de novo проявляються лише на пізніх стадіях. Дисфункція OXPHOS (рис. 3E та рис. S5C). Ці результати визначають послідовний процес, в якому індуковані стресом мітохондрії (цикл 1C) та цитоплазматичні (біосинтез серину) реагують синергічно зі збільшенням атеросклерозу в циклі TCA, змінюючи нейрональний метаболізм.
8-тижневі OXPHOS-дефіцитні PN можуть підтримувати високочастотну активність збудження та зазнавати значного метаболічного перепідключення для компенсації мітохондріальної дисфункції. Це відкриття піднімає цікаву можливість того, що навіть у цей момент ці клітини також можуть отримувати терапевтичне втручання для затримки або запобігання нейродегенерації. Пізно. Ми вирішили цю можливість за допомогою двох незалежних втручань. У першому методі ми розробили вектор Cre-залежного аденоасоційованого вірусу (AAV), щоб MFN2 міг селективно експресуватися в OXPHOS-дефіцитних PN in vivo (Рисунок S7A). AAV, що кодує MFN2, та флуоресцентний репортерний ген mCherry (Mfn2-AAV) були верифіковані в первинних нейронних культурах in vitro, що призвело до експресії MFN2 Cre-залежним чином та відновило мітохондріальну морфологію, тим самим запобігаючи нейромутації в нейронах Mfn2cKO (Рисунок S7, B, D та E). Далі ми провели експерименти in vivo для стереотаксичної доставки 8-тижневих Mfn2-AAV до кори мозочка мишей Mfn2cKO та контрольної групи, а також проаналізували 12-тижневих мишей (Рисунок 4A). Миші Mfn2cKO, які отримували лікування, загинули (Рисунок 1, A та B) (16). Вірусна трансдукція in vivo призвела до селективної експресії PN у деяких колах мозочка (Рисунок S7, G та H). Ін'єкція контрольного AAV, що експресує лише mCherry (Ctrl-AAV), не мала суттєвого впливу на ступінь нейродегенерації у тварин Mfn2cKO. Навпаки, аналіз Mfn2cKO, трансдукованих за допомогою Mfn2-AAV, показав значний захисний ефект шару клітин PN (Рисунок 4, B та C). Зокрема, щільність нейронів майже не відрізняється від контрольних тварин (Рисунок 4, B та C, а також Рисунок S7, H та I). Експресія MFN1, але не MFN2, є однаково ефективною у запобіганні загибелі нейронів (Рисунок 4C та Рисунок S7, C та F), що вказує на те, що експресія ектопічного MFN1 може ефективно компенсувати відсутність MFN2. Подальший аналіз на рівні окремого поліартериального нерва (ПН) показав, що Mfn2-AAV значною мірою відновив ультраструктуру мітохондрій, нормалізував рівні мтДНК та знизив високу експресію маркера антиангіогенезу PCx ​​(Рисунок 4, C-E). Візуальний огляд врятованих мишей Mfn2cKO у стані спокою показав, що їхня постава та рухові симптоми (рухи S1-S3) покращилися. На завершення, ці експерименти показують, що відстрочене повторне введення MFN2 у ПН з сильним дефіцитом OXPHOS є достатнім для зворотного споживання мтДНК та індукції атеросклерозу, тим самим запобігаючи дегенерації аксонів та загибелі нейронів in vivo.
(A) Схема, що показує експериментальний графік ін'єкції AAV, що кодує MFN2, коли активовано зазначений метаболічний шлях. (B) Репрезентативні конфокальні зображення 12-тижневих зрізів мозочка, трансдукованих через 8 тижнів у мишей Mfn2cKO та мічених антитілом проти кальбіндину. Праворуч: Масштабування волокон аксона. Масштаб збільшення аксона становить 450 та 75 мкм. (C) Ліворуч: Кількісна оцінка щільності клітин Пуркіньє в петлі трансдукції AAV (AAV+) (однофакторний дисперсійний аналіз; n = 3 миші). Праворуч: аналіз фокусування мтДНК у трансдукованих PN на 12-му тижні (непарний t-тест; n = 6 клітин від трьох мишей). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Репрезентативні трансмісійні електронні мікрофотографії PN зрізів мозочка Mfn2cKO, трансдукованих зазначеними вірусними векторами. Рожева маска ілюструє площу, зайняту дендритами, а жовтий пунктирний квадрат ілюструє збільшення праворуч; n позначає ядро. Масштабна шкала, 1 мкм. (E) показує приклад фарбування PCx у PN, трансдукованих через 12 тижнів. Масштабна шкала, 20 мкм. OE, надмірна експресія; FC, кратність зміни.
Зрештою, ми дослідили важливість виживання клітин, індукованого пероксидазою, у нейронних нейронів (ПН), які зазнали дисфункції OXPHOS. Ми створили mCherry, що кодує AAV-shRNA (РНК коротких шпильок), специфічно спрямовану на мРНК PCx миші (AAV-shPCx), та ввели вірус або його скремблований контроль (AAV-scr) у мозочок мишей Mfn2cKO. Ін'єкцію проводили на четвертому тижні життя (Рисунок 5A) для досягнення ефективного нокдауну PCx у період, коли експресія PCx зростала (Рисунок 3C), а шар клітин ПН був ще неушкодженим (Рисунок 1A). Варто зазначити, що нокдаун PCx (Рисунок S8A) призводить до значного прискорення загибелі ПН, яка обмежується інфікованим кільцем (Рисунок 5, B та C). Щоб зрозуміти механізм метаболічних ефектів, викликаних підвищенням регуляції PCx, ми вивчали окисно-відновний статус полінуклеотидних нейронів (ПН) після одночасної експресії PCx та AAV-опосередкованого оптичного біосенсора Grx1-roGFP2 (Рисунок S8, B-D) для оцінки відносної зміни окисно-відновного потенціалу пептиду (38). Потім ми провели двофотонну флуоресцентну довічну візуалізаційну мікроскопію (FLIM) у гострих зрізах мозку 7-тижневих Mfn2cKO або контрольних однопослідовників, щоб виявити потенційні зміни в цитоплазматичному окисно-відновному статусі після перевірки умов FLIM (Рисунок S8, E-G). Аналіз показав значне збільшення стану окиснення окремих ПН Mfn2cKO, у яких відсутня експресія PCx, що відрізняється від контрольних нейронів або ПН Mfn2cKO, що експресують лише скрембовану shRNA (Рисунок 5, D та E). Коли експресія PCx була знижена, відсоток Mfn2cKO PN, що демонструють високо окислений стан, збільшився більш ніж утричі (Рисунок 5E), що вказує на те, що підвищена регуляція PCx підтримувала окисно-відновну здатність дегенерованих нейронів.
(A) Схема, що показує експериментальний графік ін'єкції AAV, що кодує shPCx, коли активовано зазначений метаболічний шлях. (B) Репрезентативні конфокальні фотографії 8-тижневих зрізів мозочка у мишей Mfn2cKO, трансдукованих та мічених антитілом проти кальциневрину, через 4 тижні. Масштабна шкала, 450 мкм. (C) Кількісне визначення щільності клітин Пуркіньє в петлях, трансдукованих AAV (однофакторний дисперсійний аналіз; n = від 3 до 4 мишей). Дані виражені як середнє значення ± SEM; ***P<0,001. (D) Репрезентативне зображення FLIM показує середню тривалість життя 7-тижневих PN, що експресують глутатіоновий редокс-сенсор Grx1-roGFP2, за заданих експериментальних умов. Співвідношення LUT (таблиця пошуку): часовий інтервал виживання (у пікосекундах). Масштабна шкала, 25 мкм. (E) Гістограма показує розподіл значень тривалості життя Grx1-roGFP2 з (D) (n=158 до 368 клітин у двох мишей за кожної умови). Кругова діаграма над кожною гістограмою: показує кількість клітин зі значно довшими (червоний, окислений) або коротшими (синій, скорочений) значеннями тривалості життя, які перевищують 1 стандартне відхилення від середнього значення тривалості життя в CTRL-AAV-scr. (F) Запропонована модель демонструє захисний ефект підвищення регуляції нейрональної PCx.
Загалом, наведені нами тут дані показують, що реекспресія MFN2 може повністю відновити прогресуючу нейронну ...
У цьому дослідженні ми надали докази того, що реакцією нейронів (ПН) на дисфункцію OXPHOS є поступова конвергенція до атеросклерозу циклу TCA через диференціальний шлях активації, що активується метаболічними програмами. Ми підтвердили протеомний аналіз багатьма додатковими методами та виявили, що при тяжкій мітохондріальній дисфункції нейрони мають раніше невідому форму метаболічної еластичності. На наш подив, весь процес перепрограмування не обов'язково позначає термінальний метаболічний стан, який поступово та незворотно супроводжує нейродегенерацію, але наші дані свідчать про те, що він може являти собою підтримуючий нейрон навіть на стадії до загибелі клітин. Механізм функціональної компенсації. Це відкриття вказує на те, що нейрони мають значний ступінь метаболічної пластичності в організмі. Цей факт доводить, що пізніше повторне введення MFN2 може звернути експресію ключових метаболічних маркерів та запобігти дегенерації ПН. Навпаки, він пригнічує атеросклероз та прискорює нерви. транссексуал.
Одним із найцікавіших висновків нашого дослідження є те, що нейрони, яким бракує OXPHOS, можуть змінювати метаболізм циклу TCA шляхом підвищення регуляції ферментів, які специфічно стимулюють артеріосклероз. Метаболічна перебудова є поширеною рисою ракових клітин, деякі з яких покладаються на глутамін для доповнення проміжних продуктів циклу TCA для отримання відновлювальних еквівалентів, які керують дихальним ланцюгом і підтримують вироблення попередників біосинтезу ліпідів і нуклеотидів (39, 40). Нещодавнє дослідження показало, що в периферичних тканинах, що зазнають дисфункції OXPHOS, відновлення метаболізму глутаміну/глутамату також є важливою рисою (5, 41), де напрямок надходження глутаміну в цикл TCA залежить від тяжкості пошкодження OXPHOS (41). Однак бракує чітких доказів будь-якої подібності нейрональної метаболічної пластичності в організмі та її можливої ​​​​значущості в контексті захворювання. У нещодавньому дослідженні in vitro було показано, що первинні кортикальні нейрони мобілізують пули глутамату для нейротрансмісії, тим самим сприяючи окислювальному метаболізму та атеросклерозу в умовах метаболічного стресу (42). Варто зазначити, що під впливом фармакологічного пригнічення ферменту сукцинатдегідрогенази циклу ТЦА, вважається, що карбоксилювання пірувату підтримує синтез оксалоацетату в культивованих нейронах гранул мозочка (34). Однак фізіологічна значущість цих механізмів для тканини мозку (де, як вважається, атеросклероз переважно обмежується астроцитами) все ще має важливе фізіологічне значення (43). У цьому випадку наші дані показують, що полінейронні нейрони, пошкоджені OXPHOS в організмі, можуть перемикатися на деградацію BCAA та карбоксилювання пірувату, які є двома основними джерелами поповнення проміжних продуктів пулу ТЦА. Хоча було запропоновано передбачуваний внесок катаболізму BCAA в енергетичний метаболізм нейронів, окрім ролі глутамату та ГАМК у нейротрансмісії (44), досі немає доказів існування цих механізмів in vivo. Тому легко припустити, що дисфункціональні полінейронні нейрони можуть автоматично компенсувати споживання проміжних продуктів ТЦА, зумовлене процесом асиміляції, шляхом посилення атеросклерозу. Зокрема, підвищення регуляції PCx може бути необхідним для підтримки підвищеного попиту на аспарагінову кислоту, що передбачається в проліферуючих клітинах з мітохондріальною дисфункцією (45). Однак наш метаболомічний аналіз не виявив жодних суттєвих змін у стаціонарному рівні аспарагінової кислоти в нейронах Mfn2cKO (Рисунок S6A), що, ймовірно, відображає різне метаболічне використання аспарагінової кислоти між проліферуючими клітинами та постмітотичними нейронами. Хоча точний механізм підвищення регуляції PCx у дисфункціональних нейронах in vivo ще належить охарактеризувати, ми продемонстрували, що ця передчасна реакція відіграє важливу роль у підтримці окисно-відновного стану нейронів, що було продемонстровано в експериментах FLIM на зрізах мозочка. Зокрема, запобігання підвищенню регуляції PCx нейронами може призвести до більш окисленого стану та прискорити загибель клітин. Активація деградації BCAA та карбоксилювання пірувату не є способами характеристики периферичних тканин мітохондріальної дисфункції (7). Тому вони, здається, є пріоритетною ознакою нейронів з дефіцитом OXPHOS, навіть якщо не єдиною ознакою, яка важлива для нейродегенерації. .
Захворювання мозочка – це гетерогенний тип нейродегенеративного захворювання, яке зазвичай проявляється як атаксія та часто пошкоджує нейронні нейрони (ПН) (46). Ця популяція нейронів особливо вразлива до мітохондріальної дисфункції, оскільки їх селективна дегенерація у мишей достатня для відтворення багатьох рухових симптомів, що характеризують спіноцеребелярну атаксію людини (16, 47, 48). Згідно з повідомленнями, трансгенна модель миші з мутантним геном пов'язана зі спіноцеребелярною атаксією людини та має мітохондріальну дисфункцію (49, 50), що підкреслює важливість вивчення наслідків дефіциту OXPHOS при ПНПГ. Тому особливо доцільно ефективно ізолювати та вивчати цю унікальну популяцію нейронів. Однак, враховуючи, що ПН дуже чутливі до тиску та становлять невелику частку всієї популяції клітин мозочка, для багатьох досліджень на основі оміки селективне розділення їх як цілих клітин все ще є складним аспектом. Хоча досягти абсолютної відсутності забруднення інших типів клітин (особливо тканин дорослих) практично неможливо, ми поєднали ефективний етап дисоціації з FACS, щоб отримати достатню кількість життєздатних нейронів для подальшого протеомного аналізу та досягти досить високого покриття білками (близько 3000 білків) порівняно з існуючим набором даних усього мозочка (51). Зберігаючи життєздатність цілих клітин, запропонований нами тут метод дозволяє нам не тільки перевірити зміни в метаболічних шляхах у мітохондріях, але й перевірити зміни в їх цитоплазматичних аналогах, що доповнює використання міток мітохондріальної мембрани для збагачення типу клітин. Новий метод визначення кількості мітохондрій у складних тканинах (52, 53). Метод, який ми описуємо, пов'язаний не лише з вивченням клітин Пуркіньє, але й може бути легко застосований до будь-якого типу клітин для вирішення метаболічних змін у ураженому мозку, включаючи інші моделі мітохондріальної дисфункції.
Зрештою, ми визначили терапевтичне вікно під час цього процесу метаболічної перебудови, яке може повністю усунути ключові ознаки клітинного стресу та запобігти дегенерації нейронів. Тому розуміння функціональних наслідків описаної тут перебудови може дати фундаментальне розуміння можливих методів лікування для підтримки життєздатності нейронів під час мітохондріальної дисфункції. Необхідні подальші дослідження, спрямовані на аналіз змін енергетичного метаболізму в інших типах клітин мозку, щоб повністю розкрити застосовність цього принципу до інших неврологічних захворювань.
Мишей лінії MitoPark було описано раніше (31). Мишей лінії C57BL/6N з генами Mfn2, що фланкують loxP, було описано раніше (18) та схрещено з мишами L7-Cre (23). Отримане подвійне гетерозиготне потомство потім схрещували з гомозиготними мишами Mfn2loxP/Mfn2loxP для отримання специфічних для Пуркіньє нокаутів генів Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). У підгрупі схрещування алель Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) було введено шляхом додаткових схрещувань (20). Усі процедури на тваринах проводилися відповідно до європейських, національних та інституційних рекомендацій і були схвалені LandesamtfürNatur of Umwelt та Verbraucherschutz, Північний Рейн-Вестфалія, Німеччина. Робота з тваринами також відповідає рекомендаціям Європейської федерації асоціацій лабораторних тварин.
Після анестезії вивиху шийного відділу вагітної жінки ембріон миші виділяють (E13). Кору препарують у збалансованому сольовому розчині Хенкса (HBSS), доповненому 10 мМ Hepes, та пересідають на модифіковане середовище Ігла Дульбекко, що містить папаїн (20 од/мл) та цистеїн (1 мкг/мл). Тканину інкубують у середовищі DMEM (середовище DMEM) та дисоціюють її ферментативним розщепленням (Ml) при 37°C протягом 20 хвилин, а потім механічно подрібнюють у середовищі DMEM, доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою. Клітини висівають на покривні склянки, покриті полілізином, при щільності 2×10⁶ на чашку для культури діаметром 6 см або при щільності 0,5×10⁶ клітин/см² для аналізу зображень. Через 4 години середовище замінюють на безсироваткове середовище Neurobasal, що містить 1% добавки B27 та 0,5 мМ GlutaMax. Потім нейрони утримували при температурі 37°C та 5% CO2 протягом усього експерименту та годували один раз на тиждень. Щоб індукувати рекомбінацію in vitro, для обробки нейронів на другий день in vitro використовували 3 мкл (24-лунковий планшет для культивування) або 0,5 мкл (24-лунковий планшет) наступного вірусного вектора AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталожний номер 105530-AAV9) та AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталожний номер 105545-AAV9).
Комплементарна ДНК мишачих Mfn1 та Mfn2 (отримана з плазміди Addgene №23212 та №23213 відповідно) позначена послідовністю V5 (GKPIPNPLLGLDST) на C-кінці та злита з mCherry у рамці зчитування через послідовність T2A. Grx1-roGFP2 є подарунком від Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Шляхом заміни касети tdTomato за допомогою звичайних методів клонування, касету було субклоновано в основу pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (номер посилання Addgene 28306) для створення векторів pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 та pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Подібну стратегію було використано для створення контрольного вектора pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Для створення конструкції AAV-shPCx потрібен плазмідний вектор AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), який містить послідовність ДНК, що кодує shRNA, спрямовану на мишачий PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Під контролем промотора U6 використовується mCherry під контролем промотора CMV. Виробництво допоміжних векторів AAV здійснювалося згідно з інструкціями виробника (Cell Biolabs). Коротше кажучи, використовують плазміду перенесення, що несе ген, що кодує mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) або Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), а також кодує капсидний білок AAV1 та допоміжний білок. Пакувальну плазміду використовують методом фосфату кальцію. Неочищений вірусний супернатант отримували циклами заморожування-відтавання на бані з сухим льодом/етанолом та лізували клітини у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (PBS). Вектор AAV очищали за допомогою переривчастого градієнтного ультрацентрифугування з йодиксанолом (24 години при 32 000 об/хв та 4°C) та концентрували за допомогою центрифужного фільтра Amicon ultra-15. Титр геному AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 копій геному (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX визначали, як описано раніше (54), за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (qPCR)-MFN1-V5 (1,9×1013 GC/мл) та AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/мл).
Первинні нейрони зішкрібали в крижаному 1x PBS, осаджували, а потім гомогенізували в буфері для лізису 0,5% Triton X-100 / 0,5% дезоксихолату натрію/PBS, що містив фосфатазу та інгібітор протеази (Roche). Кількісне визначення білка проводили за допомогою аналізу біцинхонінової кислоти (Thermo Fisher Scientific). Потім білки розділяли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі SDS, а потім блотували на мембрану з полівініліденфториду (GE Healthcare). Блокували неспецифічні ділянки та інкубували з первинним антитілом (див. таблицю S1 для деталей) у 5% молоці в TBST (Tris-буферний фізіологічний розчин з Tween), промивали та вторинні антитіла інкубували в TBST. Інкубували з первинним антитілом протягом ночі при +4°C. Після промивання нанесіть вторинне антитіло на 2 години при кімнатній температурі. Згодом, інкубуючи той самий блот з антитілом проти β-актину, було підтверджено те саме завантаження. Виявлення шляхом перетворення на хемілюмінесценцію та посилення хемілюмінесценції (GE Healthcare).
Нейрони, попередньо висіяні на покривні скла, фіксували 4% параформальдегідом (PFA)/PBS у зазначений момент часу за кімнатної температури протягом 10 хвилин. Покривні скла спочатку просочували 0,1% розчином Triton X-100/PBS протягом 5 хвилин за кімнатної температури, а потім блокуючим буфером [3% бичачий сироватковий альбумін (BSA)/PBS]. На другий день покривні скла промивали блокуючим буфером та інкубували з відповідним вторинним антитілом, кон'югованим з флуорофором, протягом 2 годин за кімнатної температури; нарешті, зразки ретельно промивали в PBS з 4',6-діамідино-2-феніліндолом (DAPI), контрастно забарвлювали, а потім фіксували на предметному склі мікроскопа за допомогою Aqua-Poly/Mount.
Мишей (самців і самок) анестезували внутрішньочеревно кетаміном (130 мг/кг) та ксилазином (10 мг/кг) та підшкірно вводили знеболювальне карпрофен (5 мг/кг). Мишей поміщали у стереотаксичний інструмент (Kopf), оснащений теплою подушечкою. Оголювали череп та за допомогою стоматологічної бормашини витончували частину кори мозочка, що відповідає кістці мозочка (від лямбда: хвіст 1,8, латеральний 1, що відповідає часточкам IV та V). Використовуючи вигнуту голку шприца, обережно створювали невеликий отвір у черепі, щоб не порушити судинну систему нижче. Потім тонкий скляний капіляр повільно вводили в мікроотвір (від -1,3 до -1 на вентральній стороні твердої мозкової оболонки), і від 200 до 300 нл AAV вводили в мікроінжектор (Narishige) за допомогою ручних шприців (Narishige) кілька разів під низьким тиском протягом 10-20 хвилин. Після інфузії капіляр помістіть ще на 10 хвилин, щоб вірус міг повністю поширитися. Після видалення капілярів шкіру обережно зашивають, щоб мінімізувати запалення рани та дати тварині можливість одужати. Тварин лікували знеболювальними (каспофен) протягом кількох днів після операції, протягом яких ретельно контролювали їхній фізичний стан, а потім у встановлений термін їх піддали евтаназії. Усі процедури проводилися відповідно до європейських, національних та інституційних рекомендацій і були схвалені LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Північний Рейн-Вестфалія, Німеччина.
Тварин анестезували кетаміном (100 мг/кг) та ксилазином (10 мг/кг), а серце спочатку перфузували 0,1 М PBS, а потім 4% PFA у PBS. Тканину препарували та фіксували у 4% PFA/PBS протягом ночі при 4°C. Для приготування сагітальних зрізів (товщиною 50 мкм) з фіксованого мозку у PBS використовували вібраційний ніж (Leica Microsystems GmbH, Відень, Австрія). Якщо не зазначено інше, фарбування вільно плаваючих зрізів проводили, як описано вище (13), при кімнатній температурі та перемішуванні. Коротше кажучи, спочатку отримані зрізи пермеабілізували 0,5% Triton X-100/PBS протягом 15 хвилин при кімнатній температурі; для деяких епітопів (Pcx та Shmt2) – шляхом нагрівання зрізів протягом 25 хвилин у буфері tris-EDTA при 80°C (pH 9) замість цього кроку. Далі зрізи інкубували з первинними антитілами (див. таблицю S1) у блокуючому буфері (3% BSA/PBS) при 4°C протягом ночі з перемішуванням. Наступного дня зрізи промивали блокуючим буфером та інкубували з відповідними вторинними антитілами, кон'югованими з флуорофором, протягом 2 годин при кімнатній температурі; нарешті, зрізи ретельно промивали в PBS, забарвлювали DAPI, а потім фіксували за допомогою AquaPolymount на предметному склі мікроскопа.
Для візуалізації зразка використовували лазерний скануючий конфокальний мікроскоп (TCS SP8-X або TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), оснащений лазером білого світла та ультрафіолетовим лазером на 405 діодах. Шляхом збудження флуорофора та збору сигналу за допомогою гібридного детектора (HyDs) було використано програмне забезпечення LAS-X для збору об'єднаних зображень, що відповідають дискретизації Найквіста в послідовному режимі: для некількісних панелей це високодинамічні сигнали (наприклад, у соматичних клітинах та дендритах) (mtYFP). Використовуйте HyD для виявлення кількості PN у режимі BrightR. Для зменшення фону застосовується синхронізація від 0,3 до 6 нс.
Візуалізація відсортованих клітин у реальному часі. Після сортування в середовищі Neurobasal-A, що містить 1% добавки B27 та 0,5 мМ GlutaMax, клітини негайно висівали на скляні слайди, покриті полі-L-лізином (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталожний номер 80826), а потім витримували при температурі 37°C та 5% CO2 протягом 1 години, щоб клітини могли осісти. Візуалізацію в реальному часі проводили на лазерному скануючому конфокальному мікроскопі Leica SP8, оснащеному білим лазером, HyD, масляним об'єктивом 63×[1,4 числова апертура (NA)] та нагрівальним столиком.
Мишу швидко анестезували вуглекислим газом та обезголовлювали, мозок швидко видаляли з черепа та розрізали на сагітальні зрізи товщиною 200 мкм (для експерименту з міченням 13C) або 275 мкм (для експериментів з двома фотонами), заповнені наступними матеріалами: Морозиво (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Німеччина) наповнювали такими речовинами: 125 мМ крижаного, насиченого вуглецем (95% O2 та 5% CO2) розчину штучної спинномозкової рідини (ACSF) з низьким вмістом Ca2 та низьким вмістом Ca2, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрій-фосфатного буфера, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкози, 0,5 мМ CaCl2 та 3,5 мМ MgCl2 (осмотичний тиск від 310 до 330 ммоль). Перенесіть отримані зрізи мозку в камеру попередньої інкубації, що містить середовище з вищим вмістом Ca2+ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрій-фосфатного буфера, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкози, 1,0 мМ CaCl2 та 2,0 мМ MgCl2) (pH 7,4 та від 310 до 320 ммоль).
Під час процесу візуалізації зрізи переміщували до спеціальної кімнати для візуалізації, а експеримент проводили за умови безперервної перфузії ACSF за постійної температури від 32° до 33°C. Для візуалізації зрізів використовували багатофотонний лазерний скануючий мікроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), оснащений об'єктивом Leica 25x (NA 0.95, вода), титан-сапфіровий лазер (Chameleon Vision II, Coherent). Модуль FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Зміни цитоплазматичного окисно-відновного стану поліморфізмів (ПН) вимірювали за допомогою двофотонного FLIM у сагітальних зрізах мозку, де біосенсор Grx1-roGFP2 цільово впливав на ПН. У шарі ПН поле збору вибирається приблизно на 50-80 мкм нижче поверхні зрізу, щоб переконатися, що є життєздатна ПН (тобто відсутність кулькової структури або нейрональних морфологічних змін вздовж дендритів), а також подвійно позитивний сенсор roGFP2 та AAV, що кодують shRNA PCx або її контрольну послідовність (кожен з яких коекспресує mCherry). Збирають зображення з одним стеком за допомогою 2-кратного цифрового зуму [довжина хвилі збудження: 890 нм; 512 нм, 512 пікселів]. Детекція: внутрішній HyD, група фільтрів флуоресцеїнізотіоціанату (FITC)] та усереднення зображення протягом 2-3 хвилин використовуються для забезпечення збору достатньої кількості фотонів (загалом 1000 фотонів) для апроксимації кривої. Чутливість зонда Grx1-roGFP2 та перевірка умов FLIM проводилися шляхом моніторингу значення тривалості життя roGFP2 при додаванні екзогенної 10 мМ H2O2 до перфузійної ACSF (для максимізації окислення, що призводить до збільшення тривалості життя), а потім додавання 2 мМ дитіотреїтолу (мінімізація ступеня відновлення, що призводить до зменшення тривалості життя) (Рисунок S8, D-G). Використовуйте програмне забезпечення FLIMfit 5.1.1 для аналізу отриманих результатів, підганяйте криву одиничної експоненціальної регресії всього зображення до виміряної IRF (функції відгуку приладу), а χ2 приблизно дорівнює 1. Для розрахунку часу життя окремого PN маску навколо тіла нерва було намальовано вручну, а середній час життя в кожній масці використовувався для кількісної оцінки.
Аналіз мітохондріального потенціалу. Після інкубації гострого зрізу зі 100 нМ TMRM, безпосередньо доданим до перфузованого ACSF протягом 30 хвилин, зміни мітохондріального потенціалу PN вимірювали за допомогою двофотонного мікроскопа. Візуалізацію TMRM проводили шляхом збудження зонда при 920 нм та використання внутрішнього HyD (тетраметилродамінізотіоціанат: 585/40 нм) для збору сигналів; використовуючи ту саму довжину хвилі збудження, але використовуючи інший внутрішній HyD (FITC: 525/50) для візуалізації mtYFP. Використовуйте плагін Image Calculator від ImageJ для оцінки мітохондріального потенціалу на рівні окремої клітини. Коротше кажучи, рівняння плагіна: signal = min (mtYFP, TMRM) використовується для ідентифікації мітохондріальної області, яка показує сигнал TMRM у Пуркіньє Сомалій на конфокальному зображенні з одним стеком відповідного каналу. Потім площа пікселя в отриманій масці кількісно визначається, а потім нормалізується на відповідному пороговому одношаровому зображенні каналу mtYFP для отримання мітохондріальної фракції, що показує мітохондріальний потенціал.
Зображення було деконволютоване за допомогою програмного забезпечення Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Для сканованих зображень плиток монтаж однієї плитки виконується за допомогою алгоритму автоматичного зшивання, що надається програмним забезпеченням LAS-X. Після калібрування зображення використовуйте ImageJ та Adobe Photoshop для подальшої обробки зображення та рівномірного налаштування яскравості та контрастності. Для графічної підготовки використовуйте Adobe Illustrator.
Фокусний аналіз мтДНК. Кількість уражень мтДНК була кількісно визначена на зрізах мозочка, мічених антитілами проти ДНК, за допомогою конфокального мікроскопа. Кожну цільову область було створено для тіла клітини та ядра кожної клітини, і відповідну площу було розраховано за допомогою плагіна Multi Measure (програмне забезпечення ImageJ). Відніміть площу ядра від площі тіла клітини, щоб отримати площу цитоплазми. Нарешті, плагін Analyze Particles (програмне забезпечення ImageJ) був використаний для автоматичної кількісної оцінки точок цитоплазматичної ДНК, що вказують на мтДНК на пороговому зображенні, і отримані результати були нормалізовані до середнього значення PN мишей CTRL. Результати виражені як середня кількість нуклеозидів на клітину.
Аналіз експресії білків. Використовуйте плагін Image Calculator від ImageJ для оцінки експресії білків у PN на рівні окремої клітини. Коротше кажучи, на одношаровому конфокальному зображенні відповідного каналу за допомогою рівняння: signal = min (mtYFP, антитіло) ідентифікується мітохондріальна область, яка демонструє імунореактивність до певного антитіла у Пуркіна. Потім площа пікселя в отриманій масці кількісно визначається, а потім нормалізується на відповідному пороговому одношаровому зображенні каналу mtYFP для отримання мітохондріальної фракції відображеного білка.
Аналіз щільності клітин Пуркіньє. Плагін Cell Counter програми ImageJ був використаний для оцінки щільності Пуркіньє шляхом ділення кількості підрахованих клітин Пуркіньє на довжину мозочкового кільця, зайнятого підрахованими клітинами.
Підготовка та збір зразків. Мозок контрольної групи та мишей Mfn2cKO фіксували у 2% PFA/2,5% глутаральдегіді у 0,1 М фосфатному буфері (PB), а потім готували корональні зрізи з використанням інфузорій (Leica Mikrosysteme GmbH, Відень, Австрія) (товщина від 50 до 60 мкм). Далі фіксували у буфері PB у 1% тетраоксиді та 1,5% фероціаніді калію при кімнатній температурі протягом 1 години. Зрізи тричі промивали дистильованою водою, а потім фарбували 70% етанолом, що містив 1% уранілацетату, протягом 20 хвилин. Потім зрізи зневоднювали у градуйованому спирті та заливали в епоксидну смолу Durcupan ACM (ливарна смола Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, каталожний номер 14040) між силіконовими скляними слайдами, і, нарешті, полімеризували в печі протягом 48 годин при 60°C. Було обрано ділянку кори мозочка, на якій було вирізано ультратонкі зрізи товщиною 50 нм на мікроскопі Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Відень, Австрія) та відібрано на мідну щілинну сітку 2×1 мм, покриту полістирольною плівкою. Зрізи фарбували розчином 4% уранілацетату у H2O протягом 10 хвилин, промивали H2O кілька разів, потім цитратом свинцю Рейнольдса у H2O протягом 10 хвилин, а потім кілька разів промивали H2O. Мікрофотографії робили за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) з використанням цифрової камери TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Гаутінг, США). Німеччина).
Для мишей, інфікованих AAV, мозок відокремлювали та розрізали на сагітальний зріз товщиною 1 мм, а мозочок досліджували за допомогою флуоресцентного мікроскопа для ідентифікації кільця, інфікованого AAV (тобто такого, що експресує mCherry). Використовували лише експерименти, в яких ін'єкція AAV призводить до дуже високої ефективності трансдукції шару клітин Пуркіньє (тобто майже всього шару) щонайменше у двох послідовних кільцях мозочка. Петлю, трансдуковану AAV, мікродисектували для постфіксації протягом ночі (4% PFA та 2,5% глутаральдегіду в 0,1 М кокоатному буфері) та подальшої обробки. Для вбудовування EPON фіксовану тканину промивали 0,1 М кокоатним буфером натрію (Applichem) та інкубували з 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) у 0,1 М кокоатному буфері натрію (Applichem) протягом 4 годин, потім промивали протягом 2 годин. Повторювали 3 рази з 0,1 М кокамідним буфером. Згодом для інкубації кожного розчину етанолу при 4°C протягом 15 хвилин використовували висхідну серію етанолу для зневоднення тканини. Тканину переносили в пропіленоксид та інкубували протягом ночі в EPON (Sigma-Aldrich) при 4°C. Поміщали тканину у свіжий EPON при кімнатній температурі на 2 години, а потім заливали її при 62°C на 72 години. Використовували ультрамікротом (Leica Microsystems, UC6) та алмазний ніж (Diatome, Біль, Швейцарія) для вирізання ультратонких зрізів товщиною 70 нм та фарбували 1,5% уранілацетатом протягом 15 хвилин при 37°C, а потім фарбували розчином цитрату свинцю протягом 4 хвилин. Електронні мікрофотографії були зроблені за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа JEM-2100 Plus (JEOL), оснащеного камерою OneView 4K 16-біт (Gatan) та програмним забезпеченням DigitalMicrograph (Gatan). Для аналізу електронні мікрофотографії отримували з цифровим зумом 5000× або 10 000×.
Морфологічний аналіз мітохондрій. Для всіх аналізів контури окремих мітохондрій були вручну окреслені на цифрових зображеннях за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Аналізувалися різні морфологічні параметри. Щільність мітохондрій виражалася у відсотках, отриманих шляхом ділення загальної площі мітохондрій кожної клітини на площу цитоплазми (площа цитоплазми = площа клітини - площа ядра клітини) × 100. Округлість мітохондрій розраховувалася за формулою [4π∙(площа/периметр²)]. Була проаналізована морфологія мітохондрій та розділена на дві категорії («трубчасті» та «пухирчасті») відповідно до їх основних форм.
Аналіз кількості та щільності аутофагосом/лізосом. Використовуйте програмне забезпечення ImageJ, щоб вручну окреслити контури кожної аутофагосоми/лізосоми на цифровому зображенні. Площа аутофагосом/лізосом виражається у відсотках, розрахованих шляхом ділення загальної площі структури аутофагосом/лізосом кожної клітини на площу цитоплазми (площа цитоплазми = площа клітини - площа ядра) × 100. Щільність аутофагосом/лізосом розраховується шляхом ділення загальної кількості на кількість структур аутофагосом/лізосом на клітину (вимірюючи площу цитоплазми) (площа цитоплазми = площа клітини - площа ядра).
Маркування для гострого зрізання та підготовки зразків. Для експериментів, що потребують мічення глюкозою, перенесіть гострі зрізи мозку до камери попередньої інкубації, яка містить насичений вуглець (95% O2 та 5% CO2), високий Ca2+ ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрій-фосфатний буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкози, 1,0 мМ CaCl2 та 2,0 мМ MgCl2, відрегульований до pH 7,4 та від 310 до 320 мОсм), в якому глюкоза є 13C6-глюкозним заміщенням (Eurisotop, каталожний номер CLM-1396). Для експериментів, що потребують мічення піруватом, перенесіть гострі зрізи мозку у вищий Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрій-фосфатний буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкози, 1,0 мМ CaCl2 та додайте 2,0 мМ MgCl2, доведіть pH до 7,4 та від 310 до 320 мОсм) та додайте 1 мМ 1-[1-13C]пірувату (Eurisotop, каталожний номер CLM-1082). Інкубуйте зрізи протягом 90 хвилин при 37°C. Після завершення експерименту зрізи швидко промивали водним розчином (pH 7,4), що містив 75 мМ карбонату амонію, а потім гомогенізували у суміші ацетонітрилу (ACN):метанолу:води 40:40:20 (об.:об.:об.). Після інкубації зрізів на льоду протягом 30 хвилин зразки центрифугували при 21 000 g протягом 10 хвилин при 4°C, а прозорий супернатант висушували в концентраторі SpeedVac. Отриманий висушений осад метаболіту зберігали при -80°C до аналізу.
Рідинно-хроматографічний-мас-спектрометричний аналіз амінокислот, мічених 13C. Для рідинно-хроматографічного (РХ-МС) аналізу осад метаболіту ресуспендували у 75 мкл води класу LC-MS (Honeywell). Після центрифугування при 21 000 g протягом 5 хвилин при 4°C 20 мкл освітленого супернатанту використовували для аналізу потоку амінокислот, а решту екстракту негайно використовували для аналізу аніонів (див. нижче). Аналіз амінокислот проводили з використанням раніше описаного протоколу дериватизації бензоїлхлориду (55, 56). На першому етапі до 20 мкл екстракту метаболіту додавали 10 мкл 100 мМ карбонату натрію (Sigma-Aldrich), а потім до ACN класу LC додавали 10 мкл 2% бензоїлхлориду (Sigma-Aldrich). Зразок короткочасно перемішували на вортексі, а потім центрифугували при 21 000 g протягом 5 хвилин при 20°C. Перенесіть очищений супернатант у 2-мл флакон автосамплера з конічною скляною вставкою (об'єм 200 мкл). Зразки аналізували за допомогою надвисокопродуктивної системи рідинної хроматографії Acquity iClass (Waters), підключеної до високоточного мас-спектрометра високої роздільної здатності Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Для аналізу 2 мкл дериватизованого зразка вводили у високоміцну колонку з діоксидом кремнію T3 розміром 100×1,0 мм (Waters), що містить частинки розміром 1,8 мкм. Швидкість потоку становить 100 мкл/хв, а буферна система складається з буфера A (10 мМ форміату амонію та 0,15% мурашиної кислоти у воді) та буфера B (ACN). Градієнт такий: 0%B за 0 хвилин; 0%B. Від 0 до 15% B за 0 до 0,1 хвилини; від 15 до 17% B за 0,1 до 0,5 хвилини; B при 17-55% при 0,5-14 хвилинах; B при 55-70% при 14-14,5 хвилинах; при 14,5-70-100% B при 18 хвилинах; 100% B при 18-19 хвилинах; 100-0% B при 19-19,1 хвилинах; 0% B при 19,1-28 хвилинах (55, 56). Мас-спектрометр QE-HF працює в режимі позитивної іонізації з діапазоном мас m/z (співвідношення маса/заряд) від 50 до 750. Застосована роздільна здатність становить 60 000, отримана іонна мішень з контролем посилення (AGC) становить 3×106, а максимальний час іонізації – 100 мілісекунд. Джерело нагрітої електророзпилювальної іонізації (ESI) працює при напрузі розпилення 3,5 кВ, температурі капіляра 250°C, потоці повітря через оболонку 60 AU (довільні одиниці) та допоміжному потоці повітря 20 AU. 250°C. Лінза S встановлена ​​на 60 AU.
Аналіз органічних кислот, мічених 13C, методом аніонної хроматографії-мас. Залишок осаду метаболіту (55 мкл) аналізували за допомогою системи іонної хроматографії Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), підключеної до мас-спектрометра QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Коротше кажучи, 5 мкл екстракту метаболіту вводили в колонку Dionex IonPac AS11-HC, оснащену ВЕРХ (2 мм × 250 мм, розмір частинок 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) у режимі часткової петлі з коефіцієнтом заповнення 1. ) Захисна колонка Dionex IonPac AG11-HC (2 мм x 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Температура колонки підтримується на рівні 30°C, а автосамплер встановлений на 6°C. Використовуйте картридж з гідроксидом калію, що постачається з деіонізованою водою, для створення градієнта гідроксиду калію через генератор елюентів. Розділення метаболітів при швидкості потоку 380 мкл/хв, застосовуючи наступний градієнт: від 0 до 3 хвилин, 10 мМ KOH; від 3 до 12 хвилин, від 10 до 50 мМ KOH; від 12 до 19 хвилин, від 50 до 100 мМ KOH; від 19 до 21 хвилини, 100 мМ KOH; від 21 до 21,5 хвилин, від 100 до 10 мМ KOH. Колонку повторно врівноважували в середовищі 10 мМ KOH протягом 8,5 хвилин.
Елюйовані метаболіти після колонки об'єднуються з потоком ізопропанольної добавки 150 мкл/хв, а потім направляються до мас-спектрометра високої роздільної здатності, що працює в режимі негативної іонізації. МС контролює діапазон мас від m/z 50 до 750 з роздільною здатністю 60 000. AGC встановлено на 1×106, а максимальний час іонізації підтримується на рівні 100 мс. Нагріте джерело ESI працювало при напрузі розпилення 3,5 кВ. Інші налаштування джерела іонів такі: температура капіляра 275°C; потік газу оболонки 60 AU; потік допоміжного газу 20 AU при 300°C та налаштування S-лінзи на 60 AU.
Аналіз даних метаболітів, мічених 13C. Використовуйте програмне забезпечення TraceFinder (версія 4.2, Thermo Fisher Scientific) для аналізу даних співвідношення ізотопів. Ідентичність кожної сполуки була перевірена за допомогою надійної референтної сполуки та проаналізована незалежно. Для проведення аналізу ізотопного збагачення площа екстрагованої іонної хроматограми (XIC) кожного ізотопу 13C (Mn) була екстрагована з [M + H] +, де n - число вуглецю цільової сполуки, що використовується для аналізу амінокислот, або [MH] + використовується для аналізу аніонів. Точність маси XIC становить менше п'яти частин на мільйон, а точність RT - 0,05 хвилини. Аналіз збагачення виконується шляхом обчислення співвідношення кожного виявленого ізотопу до суми всіх ізотопів відповідної сполуки. Ці співвідношення наведені у відсотках для кожного ізотопу, а результати виражаються у молярному відсотку збагачення (MPE), як описано раніше (42).
Заморожений нейронний осад гомогенізували в крижаному 80% метанолі (об./об.), перемішували на вортексі та інкубували при температурі -20°C протягом 30 хвилин. Зразок знову перемішали на вортексі та перемішували при температурі +4°C протягом 30 хвилин. Зразок центрифугували при 21 000 g протягом 5 хвилин при 4°C, а потім отриманий супернатант збирали та сушили за допомогою концентратора SpeedVac при 25°C для подальшого аналізу. Як описано вище, було проведено LC-MS-аналіз амінокислот відсортованих клітин. За допомогою TraceFinder (версія 4.2, Thermo Fisher Scientific) було проведено аналіз даних з використанням моноізотопної маси кожної сполуки. Квантильна нормалізація даних метаболітів була проведена за допомогою програмного пакету preprocessCore (57).
Підготовка зрізів. Мишу швидко анестезували вуглекислим газом та обезголовлювали, мозок швидко видаляли з черепа, а для розрізання на сагітальні зрізи товщиною від 300 до 375 мкм використовували вібраційний ніж, заповнений льодом (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Німеччина). Холодна газифікація вуглецю (95% O2 та 5% CO2). Низький вміст Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрій-фосфатний буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкози, 1,0 мМ CaCl2 та 6,0 мМ MgCl2. Доводили pH до 7,4 та від 310 до 330 мОсм). Перенесіть отримані зрізи мозку в камеру, що містить вищий вміст Ca2+ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрій-фосфатний буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ D-глюкози, 4,0 мМ CaCl2 та 3,5 мМ MgCl2) pH 7,4 та тиск від 310 до 320 мОсм). Зберігайте зрізи протягом 20-30 хвилин, щоб їх можна було відновити перед записом.
Запис. Для всіх записів використовували предметний столик мікроскопа, оснащений фіксованою камерою запису та об'єктивом з 20-кратним збільшенням для імерсії у воді (Scientifica). Передбачувані клітини Пуркіньє ідентифікували за (i) розміром тіла, (ii) анатомічним розташуванням мозочка та (iii) експресією флуоресцентного репортерного гена mtYFP. Петч-піпетка з опором кінчика від 5 до 11 МОм витягується за допомогою боросилікатного скляного капіляра (GB150-10, 0,86 мм × 1,5 мм × 100 мм, Science Products, Хофхайм, Німеччина) та горизонтальної піпетки Instruments (P-1000, Sutter), Новато, Каліфорнія. Всі записи виконували за допомогою підсилювача ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Там, Німеччина), який керувався програмним забезпеченням Signal (версія 6.0, Cambridge Electronic, Кембридж, Великобританія). Експеримент записувався з частотою дискретизації 12,5 кГц. Сигнал фільтрується двома короткопрохідними фільтрами Бесселя з частотами зрізу 1,3 та 10 кГц відповідно. Ємність мембрани та піпетки компенсується схемою компенсації за допомогою підсилювача. Всі експерименти проводилися під керуванням камери Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Німеччина), яка керувалася програмним забезпеченням Hokawo (версія 2.8, Hamamatsu, Gerden, Німеччина).
Рутинна конфігурація та аналіз цілих клітин. Безпосередньо перед записом наповніть піпетку внутрішнім розчином, що містить такі речовини: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ глюконат калію, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ АТФ (Mg), 0,5 мМ гуанозинтрифосфат (GTP) (Na) та 10,0 мМ креатинінфосфат, pH яких було доведено до 7,25, а осмотичний тиск становив 290 мОсм (сахароза). Відразу після прикладання сили 0 пА для розриву мембрани було виміряно мембранний потенціал спокою. Вхідний опір вимірюють шляхом прикладання гіперполяризованих струмів -40, -30, -20 та -10 пА. Виміряйте величину вольтажної характеристики та використовуйте закон Ома для розрахунку вхідного опору. Спонтанну активність реєстрували за допомогою вольтажного клеща протягом 5 хвилин, а sPSC ідентифікували та вимірювали в Igor Pro (версія 32 7.01, WaveMetrics, Лейк-Освего, Орегон, США) за допомогою напівавтоматичного сценарію розпізнавання. Крива IV та стаціонарний струм вимірюються шляхом затискання батареї при різних потенціалах (починаючи від -110 мВ) та збільшення напруги з кроком 5 мВ. Виробництво AP перевіряли шляхом подачі деполяризуючого струму. Затисніть комірку при -70 мВ під час подачі імпульсу деполяризуючого струму. Відрегулюйте крок кожного блоку запису окремо (від 10 до 60 пА). Розрахуйте максимальну частоту AP, вручну підрахувавши піки імпульсів, які викликають найвищу частоту AP. Поріг AP аналізується за допомогою другої похідної імпульсу деполяризації, який першим запускає один або кілька AP.
Конфігурація та аналіз перфорованого патчу. Виконайте запис перфорованого патчу, використовуючи стандартні протоколи. Використовуйте піпетку без АТФ та ГТФ, яка не містить наступних інгредієнтів: 128 мМ глюконату K, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,1 мМ EGTA та 2 мМ MgCl2, та доведіть pH до 7,2 (за допомогою KOH). АТФ та ГТФ виключаються з внутрішньоклітинного розчину, щоб запобігти неконтрольованій проникності клітинної мембрани. Піпетку-патч заповнюють внутрішнім розчином, що містить амфотерицин (приблизно від 200 до 250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich), для отримання запису перфорованого патчу. Амфотерицин розчиняли в диметилсульфоксиді (кінцева концентрація: від 0,1 до 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Концентрація використаного DMSO не мала суттєвого впливу на досліджувані нейрони. Під час процесу пробивання опір каналу (Ra) безперервно контролювався, а експеримент розпочинався після стабілізації амплітуди Ra та AP (20-40 хвилин). Спонтанна активність вимірювалася за допомогою клем напруги та/або струму протягом 2-5 хвилин. Аналіз даних проводився за допомогою Igor Pro (версія 7.05.2, WaveMetrics, США), Excel (версія 2010, Microsoft Corporation, Редмонд, США) та GraphPad Prism (версія 8.1.2, GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Каліфорнія). Для ідентифікації спонтанних AP використовується плагін IgorPro NeuroMatic v3.0c. Автоматично ідентифікуйте AP за допомогою заданого порогу, який налаштовується індивідуально для кожного запису. Використовуючи інтервал спайків, визначте частоту спайків з максимальною миттєвою частотою спайків та середньою частотою спайків.
Виділення PN. Адаптувавши до раніше опублікованого протоколу, PN були очищені з мозочка миші на певній стадії (58). Коротше кажучи, мозочок був препарований та подрібнений у крижаному середовищі для дисоціації [без HBSS Ca2+ та Mg2+, з додаванням 20 мМ глюкози, пеніциліну (50 од./мл) та стрептоміцину (0,05 мг/мл)], а потім середовище було перетравлено в папаїні [HBSS, з додаванням 1-цистеїну·HCl (1 мг/мл), папаїну (16 од./мл) та дезоксирибонуклеази I (ДНаза I; 0,1 мг/мл)]. Обробляли протягом 30 хвилин при 30°C. Спочатку промийте тканини в середовищі HBSS, що містить яєчний слиз (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) та ДНКазу (0,1 мг/мл) при кімнатній температурі для запобігання ферментативному розщепленню, а потім у середовищі HBSS, що містить 20 мМ глюкози. Обережне подрібнення в HBSS, пеніциліну (50 од/мл), стрептоміцину (0,05 мг/мл) та ДНКази (0,1 мг/мл) вивільняє окремі клітини. Отриману клітинну суспензію фільтрували через клітинне ситечко 70 мкм, потім клітини осаджували центрифугуванням (1110 об/хв, 5 хвилин, 4°C) та ресуспендували в сортувальному середовищі [HBSS, доповнений 20 мМ глюкозою, 20% фетальної бичачої сироватки, пеніциліну (50 од/мл) та стрептоміцину (0,05 мг/мл)]; оцініть життєздатність клітин за допомогою пропідію йодиду та доведіть щільність клітин до 1×106 - 2×106 клітин/мл. Перед проточною цитометрією суспензію фільтрували через клітинне ситечко з розміром пор 50 мкм.
Проточний цитометр. Сортування клітин проводили при 4°C за допомогою приладу FACSAria III (BD Biosciences) та програмного забезпечення FACSDiva (BD Biosciences, версія 8.0.1). Суспензію клітин сортували за допомогою сопла 100 мкм під тиском 20 psi зі швидкістю ~2800 подій/с. Оскільки традиційні критерії стробування (розмір клітин, бімодальна дискримінація та характеристики розсіювання) не можуть забезпечити правильну ізоляцію PN від інших типів клітин, стратегія стробування встановлюється на основі прямого порівняння інтенсивності YFP та аутофлуоресценції у мишей mitoYFP+ ​​​​та контрольних мишей mitoYFP −. YFP збуджується шляхом опромінення зразка лазерною лінією 488 нм, а сигнал детектується за допомогою смугового фільтра 530/30 нм. У мишей mitoYFP+ ​​​​відносна сила репортерного гена Rosa26-mitoYFP також використовується для розрізнення фрагментів тіла нейронів та аксона. 7-AAD збуджують жовтим лазером з довжиною хвилі 561 нм та детектують за допомогою смугового фільтра 675/20 нм для виключення мертвих клітин. Щоб одночасно відокремити астроцити, клітинну суспензію забарвлюють ACSA-2-APC, потім зразок опромінюють лазерною лінією 640 нм, і для детектування сигналу використовують смуговий фільтр 660/20 нм.
Зібрані клітини осаджували центрифугуванням (1110 об/хв, 5 хвилин, 4°C) та зберігали при температурі -80°C до використання. Мишей Mfn2cKO та їхніх дитинчат класифікували в один день, щоб мінімізувати варіабельність процедури. Представлення та аналіз даних FACS проводили за допомогою програмного забезпечення FlowJo (FlowJo LLC, Ашленд, Орегон, США).
Як згадувалося вище (59), ПЛР у реальному часі використовується для виділення ДНК з відсортованих нейронів для подальшого кількісного визначення мтДНК. Лінійність та порогову чутливість спочатку перевіряли шляхом проведення кПЛР на різній кількості клітин. Коротше кажучи, збирають 300 PN у буфері для лізису, що складається з 50 мМ трис-HCl (pH 8,5), 1 мМ ЕДТА, 0,5% Tween 20 та протеїнази K (200 нг/мл), та інкубують при 55°C протягом 120 хвилин. Клітини далі інкубують при 95°C протягом 10 хвилин, щоб забезпечити повну інактивацію протеїнази K. Використовуючи зонд TaqMan (Thermo Fisher), специфічний до mt-Nd1, мтДНК вимірювали за допомогою напівкількісної ПЛР у системі 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, каталожний номер Mm04225274_s1), гени mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталожний номер AIVI3E8) та 18S (Thermo Fisher Scientific, каталожний номер Hs99999901_s1).
Підготовка зразка протеому. Розчин нагрівали при 95°C протягом 10 хвилин та обробляли ультразвуком у буфері для лізису [6 М гуанідину хлорид, 10 мМ трис(2-карбоксиетил)фосфіну гідрохлорид, 10 мМ хлорацетамід та 100 мМ трис-лізу, заморожені нейронні гранули в HCl]. На Bioruptor (Diagenode) протягом 10 хвилин (30 секунд імпульсу / 30 секунд паузи). Зразок розводили 1:10 у 20 мМ трис-HCl (pH 8,0), змішували з 300 нг трипсину золота (Promega) та інкубували протягом ночі при 37°C для досягнення повного перетравлення. На другий день зразок центрифугували при 20 000 g протягом 20 хвилин. Супернатант розводили 0,1% мурашиною кислотою, а розчин знесолювали за допомогою саморобних наконечників StageTips. Зразок висушили на приладі SpeedVac (концентратор Eppendorf plus 5305) при 45°C, а потім пептид суспендували в 0,1% мурашиній кислоті. Усі зразки готували одночасно однією особою. Для аналізу зразків астроцитів 4 мкг знесолених пептидів мітили тандемною мас-міткою (TMT10plex, каталожний номер 90110, Thermo Fisher Scientific) зі співвідношенням пептиду до реагенту TMT 1:20. Для мічення TMT 0,8 мг реагенту TMT ресуспендували в 70 мкл безводного ACN, а висушений пептид розчинили в 9 мкл 0,1 M TEAB (триетиламоній бікарбонату), до якого додали 7 мкл реагенту TMT в ACN. Концентрація становила 43,75%. Після 60 хвилин інкубації реакцію гасили 2 мкл 5% гідроксиламіну. Мічені пептиди збирали, висушували, ресуспендували у 200 мкл 0,1% мурашиної кислоти (КК), розділяли на дві частини, а потім знесолювали за допомогою саморобних наконечників StageTips. Використовуючи надвисокоефективний рідинний хроматограф UltiMate 3000 (надвисокоефективний рідинний хроматограф UltiMate 3000), одну з двох половин фракціонували на хроматографічній колонці Acquity розміром 1 мм x 150 мм, заповненій частинками C18 розміром 130 Å1,7 мкм (Waters, каталожний номер SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Розділяли пептиди зі швидкістю потоку 30 мкл/хв, розділяли від 1% до 50% буфера B протягом 85 хвилин зі ступінчастим градієнтом 96 хвилин, від 50% до 95% буфера B протягом 3 хвилин, потім 8 хвилин для 95% буфера B; Буфер А містить 5% ACN та 10 мМ бікарбонату амонію (ABC), а буфер B містить 80% ACN та 10 мМ ABC. Збирайте фракції кожні 3 хвилини та об'єднуйте їх у дві групи (1 + 17, 2 + 18 тощо) і сушіть їх у вакуумній центрифузі.
Аналіз LC-MS/MS. Для мас-спектрометрії пептиди (номер r119.aq) розділяли на аналітичній колонці PicoFrit діаметром 25 см та внутрішнім діаметром 75 мкм (нова об'єктивна лінза, номер деталі PF7508250), оснащеній середовищем ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 мкм (Dr. Maisch, mat), використовували EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Німеччина). Колонку підтримували при температурі 50°C. Буфери A та B – це 0,1% мурашина кислота у воді та 0,1% мурашина кислота у 80% ACN відповідно. Пептиди розділяли від 6% до 31% буфера B протягом 65 хвилин та від 31% до 50% буфера B протягом 5 хвилин з градієнтом 200 нл/хв. Елюйовані пептиди аналізували на мас-спектрометрі Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Вимірювання m/z пептидного попередника виконується з роздільною здатністю 120 000 в діапазоні від 350 до 1500 m/z. Використовуючи 27% нормалізовану енергію зіткнення, найсильніший попередник із зарядовим станом від 2 до 6 вибирається для розщеплення методом дисоціації пастки C високої енергії (HCD). Час циклу встановлено на 1 с. Значення m/z пептидного фрагмента вимірювали в іонній пастці, використовуючи найменшу мішень AGC 5×104 та максимальний час інжекції 86 мс. Після фрагментації попередник поміщали до списку динамічного виключення на 45 с. Мічені TMT пептиди розділяли на колонці Acclaim PepMap 50 см, 75 мкм (Thermo Fisher Scientific, каталожний номер 164942), а спектри міграції аналізували на мас-спектрометрі Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), оснащеному обладнанням для високопольових асиметричних хвильових іонів (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific), яке працює при двох компенсаційних напругах -50 та -70 В. MS3, вибраний на основі попередника синхронізації, використовується для вимірювання сигналу TMT-репортажних іонів. Розділення пептидів проводили на EASY-nLC 1200 з використанням 90% лінійного градієнтного елюювання з концентрацією буфера від 6% до 31%; буфер A становив 0,1% FA, а буфер B - 0,1% FA та 80% ACN. Аналітична колонка працювала при 50°C. Використовуйте FreeStyle (версія 1.6, Thermo Fisher Scientific) для розділення вихідного файлу відповідно до компенсаційної напруги FAIMS.
Ідентифікація та кількісне визначення білків. Використовуючи інтегровану пошукову систему Andromeda, вихідні дані були проаналізовані за допомогою MaxQuant версії 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). На додаток до послідовностей Cre-рекомбінази та YFP, отриманих з Aequorea victoria, були проведені пошуки спектрів пептидних фрагментів на наявність канонічної послідовності та ізоформної послідовності референсного протеому миші (ідентифікатор протеому UP000000589, завантажений з UniProt у травні 2017 року). Окислення метіоніну та N-кінцеве ацетилювання білка були встановлені як варіативні модифікації; метилювання цистеїну карбамоїлом було встановлено як фіксовані модифікації. Параметри розщеплення встановлені на «специфічність» та «трипсин/P». Мінімальна кількість пептидів та пептидів razor, що використовуються для ідентифікації білка, становить 1; мінімальна кількість унікальних пептидів – 0. За умов зіставлення пептидних карт, коефіцієнт ідентифікації білка становив 0,01. Опція «Другий пептид» увімкнена. Використовуйте опцію «зіставлення між прогонами» для передачі успішних ідентифікацій між різними вихідними файлами. Використовуйте мінімальне співвідношення LFQ, що дорівнює 1, для кількісного визначення без міток (LFQ) (60). Інтенсивність LFQ фільтрується принаймні для двох дійсних значень принаймні в одній групі генотипів у кожній часовій точці та екстрапольується з нормального розподілу з шириною 0,3 та зміщенням вниз на 1,8. Використовуйте обчислювальну платформу Perseus (https://maxquant.net/perseus/) та R (https://r-project.org/) для аналізу результатів LFQ. Для диференціального аналізу експресії використовувався двофакторний помірний t-тест з програмного пакету limma (61). Дослідницький аналіз даних проводиться за допомогою ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally та pheatmap. Дані протеоміки на основі TMT аналізували за допомогою MaxQuant версії 1.6.10.43. Шукайте необроблені дані протеоміки в базі даних протеоміки людини UniProt, яка була завантажена у вересні 2018 року. Аналіз включає коефіцієнт корекції ізотопної чистоти, наданий виробником. Використовуйте limma в R для аналізу диференціальних виразів. Вихідні дані, результати пошуку в базі даних, а також робочий процес і результати аналізу даних зберігаються в альянсі ProteomeXchange через партнерський репозиторій PRIDE з ідентифікатором набору даних PXD019690.
Функціональні анотації збагачують аналіз. Для визначення насиченості термінів функціональних анотацій набору даних через 8 тижнів було використано інструмент Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) (Рисунок 1). Коротко кажучи, кількісний список білків, отриманий в результаті аналізу даних LC-MS/MS (тандемна мас-спектрометрія), використовується з такими критеріями фільтрації: Mus musculus вибрано як вид та фон, а категорія показує значення P, скориговане за Бенджаміні для збагачення 0,05 або нижче, яке вважається значним. Для цього графіка показано п'ять найвищих надлишкових категорій у кожному кластері на основі скоригованого значення P. Використовуючи множинний t-тест, використовуючи двоступеневу лінійну програму буста Бенджаміні, Крігера та Єкутієлі (Q = 5%), проводиться аналіз експресії білків з часом для важливих кандидатів, визначених у кожній категорії, і кожен рядок аналізується окремо. Немає потреби застосовувати послідовне стандартне відхилення.
Щоб порівняти результати цього дослідження з опублікованими базами даних та створити діаграму Венна на рисунку 1, ми поєднали кількісний список білків з анотаціями MitoCarta 2.0 (24). Для створення діаграми скористалися онлайн-інструментом Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Для отримання детальної інформації про статистичні процедури, що використовуються для протеомного аналізу, будь ласка, зверніться до відповідного розділу «Матеріали та методи». Для всіх інших експериментів детальну інформацію можна знайти у відповідній легенді. Якщо не зазначено інше, всі дані виражені як середнє значення ± SEM, а всі статистичні аналізи були виконані за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 8.1.2.
Додаткові матеріали до цієї статті див. за посиланням http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Це стаття з відкритим доступом, що розповсюджується відповідно до умов ліцензії Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, яка дозволяє використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії, за умови, що кінцеве використання не має комерційної вигоди, і передумова полягає в тому, що оригінальна робота є правильною. Посилання.
Примітка: Ми просимо вас надати свою адресу електронної пошти лише для того, щоб людина, яку ви рекомендуєте для сторінки, знала, що ви хочете, щоб вона побачила цей лист, і що це не спам. Ми не збиратимемо жодних адрес електронної пошти.
Це питання використовується для перевірки, чи ви відвідувач, та запобігання автоматичному надсиланню спаму.
Е. Моторі, І. Атанасов, С. В. Кочан, К. Фольц-Донахью, В. Сактівелу, П. Джаваліско, Н. Тоні, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Протеомний аналіз дисфункціональних нейронів показав, що метаболічні програми активуються для протидії нейродегенерації.
Е. Моторі, І. Атанасов, С. В. Кочан, К. Фольц-Донахью, В. Сактівелу, П. Джаваліско, Н. Тоні, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Протеомний аналіз дисфункціональних нейронів показав, що метаболічні програми активуються для протидії нейродегенерації.
©2020 Американська асоціація сприяння розвитку науки. всі права захищені. AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.