Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращих результатів рекомендуємо використовувати новішу версію браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображаємо сайт без стилізації та JavaScript.
Пропіонова кислота (ППК) використовується для вивчення ролі мітохондріальної дисфункції в нейророзвиткових розладах, таких як розлад аутистичного спектру. Відомо, що ППК порушує біогенез, метаболізм та оновлення мітохондрій. Однак вплив ППК на динаміку, поділ та злиття мітохондрій залишається проблематичним через складну часову природу цих механізмів. Тут ми використовуємо додаткові методи кількісної візуалізації, щоб дослідити, як ППК впливає на ультраструктуру, морфологію та динаміку мітохондрій у нейроноподібних клітинах SH-SY5Y. ППК (5 мМ) спричинила значне зменшення площі мітохондрій (p < 0,01), діаметра та окружності Ферета (p < 0,05) та площі 2 (p < 0,01). Аналіз локатора мітохондріальних подій показав значне збільшення (p < 0,05) подій поділу та злиття, тим самим зберігаючи цілісність мітохондріальної мережі в умовах стресу. Крім того, експресія мРНК cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) та OPA1 (p < 0,05) була значно знижена. 01). Це ілюструє ремоделювання мітохондріальної морфології, біогенезу та динаміки для підтримки функції в умовах стресу. Наші дані дають нове розуміння впливу PPA на динаміку мітохондрій та підкреслюють корисність методів візуалізації для вивчення складних регуляторних механізмів, що беруть участь у мітохондріальних стресових реакціях.
Мітохондрії є невід'ємними учасниками різноманітних клітинних функцій, що виходять за рамки їх типових ролей у виробництві енергії та біосинтезі. Мітохондріальний метаболізм є ключовим регулятором кальцієвої сигналізації, метаболічного та окисно-відновного гомеостазу, запальної сигналізації, епігенетичних модифікацій, проліферації клітин, диференціації та запрограмованої клітинної смерті1. Зокрема, мітохондріальний метаболізм є критичним для розвитку, виживання та функціонування нейронів і широко бере участь у різних проявах нейропатології2,3,4.
Протягом останнього десятиліття метаболічний статус став центральним регулятором нейрогенезу, диференціації, дозрівання та пластичності5,6. Останнім часом морфологія та динаміка мітохондрій стали особливо важливими компонентами мітозозу, динамічного процесу, який підтримує пул здорових мітохондрій у клітинах. Динаміка мітохондрій регулюється складними взаємозалежними шляхами, починаючи від мітохондріального біогенезу та біоенергетики і закінчуючи мітохондріальним поділом, злиттям, транспортом та кліренсом7,8. Порушення будь-якого з цих інтегративних механізмів порушує підтримку здорових мітохондріальних мереж і має глибокі функціональні наслідки для нейророзвитку9,10. Дійсно, порушення регуляції динаміки мітохондрій спостерігається при багатьох психічних, нейродегенеративних та нейророзвиткових розладах, включаючи розлади аутистичного спектру (РАС)11,12.
Розлад аутистичного спектру (РАС) – це гетерогенний нейророзвиток зі складною генетичною та епігенетичною архітектурою. Спадковість РАС безперечна, але молекулярна етіологія, що лежить в основі РАС, залишається погано вивченою. Накопичені дані доклінічних моделей, клінічних досліджень та мультиомних молекулярних наборів даних надають все більше доказів мітохондріальної дисфункції при РАС13,14. Раніше ми провели скринінг метилювання ДНК у повному геномі в когорті пацієнтів з РАС та виявили диференційно метильовані гени, кластеризовані вздовж мітохондріальних метаболічних шляхів15. Згодом ми повідомили про диференціальне метилювання центральних регуляторів біогенезу та динаміки мітохондрій, що було пов'язано зі збільшенням кількості копій мтДНК та зміненим профілем метаболізму сечі при РАС16. Наші дані надають все більше доказів того, що динаміка мітохондрій та гомеостаз відіграють центральну роль у патофізіології РАС. Тому покращення механістичного розуміння взаємозв'язку між динамікою, морфологією та функцією мітохондрій є ключовою метою поточних досліджень неврологічних захворювань, що характеризуються вторинною мітохондріальною дисфункцією.
Молекулярні методи часто використовуються для вивчення ролі специфічних генів у стресових реакціях мітохондрій. Однак цей підхід може бути обмежений багатогранною та часовою природою механізмів мітотичного контролю. Більше того, диференціальна експресія мітохондріальних генів є непрямим показником функціональних змін, особливо враховуючи, що зазвичай аналізується лише обмежена кількість генів. Тому було запропоновано більш прямі методи вивчення мітохондріальної функції та біоенергетики17. Морфологія мітохондрій тісно пов'язана з динамікою мітохондрій. Форма, зв'язність та структура мітохондрій мають вирішальне значення для виробництва енергії та виживання мітохондрій та клітин5,18. Крім того, різні компоненти мітозу зосереджені на змінах мітохондріальної морфології, що може служити корисними кінцевими точками мітохондріальної дисфункції та забезпечити основу для подальших механістичних досліджень.
Морфологію мітохондрій можна безпосередньо спостерігати за допомогою просвічувальної електронної мікроскопії (ТЕМ), що дозволяє детально вивчати ультраструктуру клітин. ТЕМ безпосередньо візуалізує морфологію, форму та структуру мітохондріальних крист на рівні окремих мітохондрій, а не покладаючись виключно на транскрипцію генів, експресію білків або параметри мітохондріальної функції в клітинних популяціях17,19,20. Крім того, ТЕМ сприяє вивченню взаємодій між мітохондріями та іншими органелами, такими як ендоплазматичний ретикулум та аутофагосоми, які відіграють ключову роль у мітохондріальній функції та гомеостазі21,22. Таким чином, це робить ТЕМ гарною відправною точкою для вивчення мітохондріальної дисфункції, перш ніж зосередитися на конкретних шляхах або генах. Оскільки мітохондріальна функція стає все більш актуальною для нейропатології, існує явна потреба мати можливість безпосередньо та кількісно вивчати морфологію та динаміку мітохондрій в нейрональних моделях in vitro.
У цій статті ми розглядаємо динаміку мітохондрій у нейрональній моделі мітохондріальної дисфункції при розладі аутистичного спектру. Раніше ми повідомляли про диференціальне метилювання пропіоніл-КоА-карбоксилази бета (PCCB) в ASD15, субодиниці мітохондріального ферменту пропіоніл-КоА-карбоксилази PCC. Відомо, що порушення регуляції PCC викликає токсичне накопичення пропіонільних похідних, включаючи пропіонову кислоту (PPA)23,24,25. Було показано, що PPA порушує нейрональний метаболізм та змінює поведінку in vivo, і є встановленою тваринною моделлю для вивчення нейророзвиткових механізмів, задіяних у ASD26,27,28. Крім того, повідомлялося, що PPA порушує потенціал мітохондріальної мембрани, біогенез та дихання in vitro та широко використовується для моделювання мітохондріальної дисфункції в нейронах29,30. Однак вплив мітохондріальної дисфункції, індукованої PPA, на морфологію та динаміку мітохондрій залишається погано вивченим.
Це дослідження використовує додаткові методи візуалізації для кількісної оцінки впливу PPA на морфологію, динаміку та функцію мітохондрій у клітинах SH-SY5Y. Спочатку ми розробили метод TEM для візуалізації змін у морфології та ультраструктурі мітохондрій17,31,32. Враховуючи динамічну природу мітохондрій33, ми також використовували аналіз локалізатора мітохондріальних подій (MEL) для кількісної оцінки змін у балансі між подіями поділу та злиття, кількістю та об'ємом мітохондрій під впливом стресу PPA. Нарешті, ми дослідили, чи пов'язані морфологія та динаміка мітохондрій зі змінами в експресії генів, що беруть участь у біогенезі, поділі та злитті. У сукупності наші дані ілюструють складність з'ясування складності механізмів, що регулюють динаміку мітохондрій. Ми підкреслюємо корисність TEM у вивченні морфології мітохондрій як вимірюваної конвергентної кінцевої точки мітозу в клітинах SH-SY5Y. Крім того, ми підкреслюємо, що дані TEM надають найбагатшу інформацію в поєднанні з методами візуалізації, які також фіксують динамічні події у відповідь на метаболічний стрес. Подальша характеристика молекулярних регуляторних механізмів, що підтримують мітоз нейрональних клітин, може дати важливе розуміння мітохондріального компонента нервової системи та нейродегенеративних захворювань.
Щоб викликати мітохондріальний стрес, клітини SH-SY5Y обробляли PPA з використанням 3 мМ та 5 мМ пропіонату натрію (NaP). Перед TEM зразки піддавали кріогенній підготовці зразків з використанням заморожування під високим тиском та заморожування (рис. 1a). Ми розробили автоматизований конвеєр аналізу мітохондріальних зображень для вимірювання восьми морфологічних параметрів мітохондріальних популяцій у трьох біологічних повторностях. Ми виявили, що обробка PPA суттєво змінила чотири параметри: площу 2, площу, периметр та діаметр Фере (рис. 1b–e). Площа 2 значно зменшилася як при обробці 3 мМ, так і 5 мМ PPA (p = 0,0183 та p = 0,002 відповідно) (рис. 1b), тоді як площа (p = 0,003), периметр (p = 0,0106) та діаметр Фере значно зменшилися. Спостерігалося значне зниження (p = 0,0172) у групі обробки 5 мМ порівняно з контрольною групою (рис. 1c–e). Значне зменшення площі та окружності показало, що клітини, оброблені 5 мМ PPA, мали менші, більш округлі мітохондрії, і що ці мітохондрії були менш витягнутими, ніж у контрольних клітинах. Це також узгоджується зі значним зменшенням діаметра Фере, незалежного параметра, що вказує на зменшення найбільшої відстані між краями частинок. Спостерігалися зміни в ультраструктурі крист: кристи стали менш вираженими під впливом стресу PPA (рис. 1a, панель B). Однак не всі зображення чітко відображали ультраструктуру крист, тому кількісний аналіз цих змін не проводився. Ці дані TEM можуть відображати три можливі сценарії: (1) PPA посилює поділ або пригнічує злиття, що призводить до зменшення розмірів існуючих мітохондрій; (2) посилений біогенез створює нові, менші мітохондрії або (3) індукує обидва механізми одночасно. Хоча ці стани неможливо розрізнити за допомогою TEM, значні морфологічні зміни вказують на зміни в гомеостазі та динаміці мітохондрій під впливом стресу PPA. Згодом ми дослідили додаткові параметри для подальшої характеристики цієї динаміки та потенційних механізмів, що лежать в її основі.
Пропіонова кислота (PPA) ремоделює морфологію мітохондрій. (a) Репрезентативні зображення трансмісійної електронної мікроскопії (TEM), що показують, що розмір мітохондрій зменшується, а мітохондрії стають меншими та більш округлими зі збільшенням обробки PPA; 0 мМ (необроблені), 3 мМ та 5 мМ відповідно. Червоні стрілки вказують на мітохондрії. (b–e) Клітини SH-SY5Y, оброблені PPA протягом 24 годин, були підготовлені до TEM, а результати проаналізовані за допомогою Fiji/ImageJ. Чотири з восьми параметрів показали значні відмінності між контрольними (необроблені, 0 мМ PPA) та обробленими (3 мМ та 5 мМ PPA) клітинами. (b) Область 2, (c) Площа, (d) Периметр, (e) Діаметр Ферета. Для визначення значних відмінностей (p < 0,05) використовували однофакторний дисперсійний аналіз (контроль проти обробки) та тест множинного порівняння Даннета. Точки даних представляють середнє значення мітохондрій для кожної окремої клітини, а смуги похибок представляють середнє значення ± SEM. Показані дані представляють n = 3, щонайменше 24 клітини на повторність; загалом було проаналізовано 266 зображень; * вказує на p < 0,05, ** вказує на p < 0,01.
Щоб краще охарактеризувати реакцію динаміки мітохондрій на PPA, ми забарвили мітохондрії тетраметилродаміну етиловим естером (TMRE) та використали покадрову мікроскопію та MEL-аналіз для локалізації та кількісної оцінки мітохондрій через 24 години при 3 та 5 мМ PPA. Обробка подій поділу та злиття. (Рис. 2a). Після MEL-аналізу мітохондрії були додатково проаналізовані для кількісної оцінки кількості мітохондріальних структур та їх середнього об'єму. Ми спостерігали невелике, але значне збільшення кількості подій поділу, що відбувалися при 3 мМ [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] порівняно з подіями поділу [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] та злиття [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] та злиття [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (<0,05)], що значно збільшилося при 5 мМ порівняно з контролем (Рис. 3b). Кількість мітохондрій значно збільшилася як при 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], так і при 5 мМ [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (рис. 3c), тоді як середній об'єм кожної мітохондріальної структури залишився незмінним (рис. 3c). 3d). У сукупності це свідчить про те, що ремоделювання мітохондріальної динаміки служить компенсаторною реакцією, яка успішно підтримує цілісність мітохондріальної мережі. Збільшення кількості подій поділу при 3 мМ PPA свідчить про те, що збільшення кількості мітохондрій частково зумовлене мітохондріальним поділом, але враховуючи, що середній об'єм мітохондрій залишається практично незмінним, біогенез не можна виключати як додаткову компенсаторну реакцію. Однак ці дані узгоджуються з меншими, круглими мітохондріальними структурами, що спостерігаються за допомогою TEM, а також демонструють значні зміни в мітохондріальній динаміці, викликані PPA.
Пропіонова кислота (PPA) індукує динамічне ремоделювання мітохондрій для підтримки цілісності мережі. Клітини SH-SY5Y культивували, обробляли 3 та 5 мМ PPA протягом 24 годин та фарбували TMRE та Hoechst 33342 з подальшим MEL-аналізом. (a) Репрезентативні зображення покадрової мікроскопії, що відображають колір та бінаризовані проекції максимальної інтенсивності в момент часу 2 (t2) для кожної умови. Вибрані області, позначені на кожному бінарному зображенні, покращені та відображені в 3D у трьох різних часових рамках (t1-t3) для ілюстрації динаміки з часом; події злиття виділені зеленим кольором; події поділу виділені зеленим кольором. Відображено червоним кольором. (b) Середня кількість динамічних подій на умову. (c) Середня кількість мітохондріальних структур на клітину. (d) Середній об'єм (мкм3) кожної мітохондріальної структури на клітину. Показані дані є репрезентативними для n = 15 клітин на групу лікування. Показані смуги похибки представляють середнє значення ± SEM, масштабна шкала = 10 мкм, * p < 0,05.
Пропіонова кислота (PPA) викликає пригнічення транскрипції генів, пов'язаних з динамікою мітохондрій. Клітини SH-SY5Y обробляли 3 та 5 мМ PPA протягом 24 годин. Відносну кількісну оцінку генів проводили за допомогою RT-qPCR та нормалізували до B2M. Гени мітохондріального біогенезу (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 та (d) NFE2L2. Гени злиття та поділу мітохондрій (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 та (i) DRP1. Значні відмінності (p < 0,05) перевіряли за допомогою однофакторного ANOVA (контроль проти лікування) та тесту множинних порівнянь Даннета: * вказує на p < 0,05, ** вказує на p < 0,01, а **** вказує на p < 0,0001. Стовпчики представляють середнє значення експресії ± SEM. Показані дані представляють n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) та n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) біологічних повторностей.
Дані аналізів TEM та MEL разом вказують на те, що PPA змінює морфологію та динаміку мітохондрій. Однак ці методи візуалізації не дають розуміння основних механізмів, що керують цими процесами. Тому ми дослідили експресію мРНК дев'яти ключових регуляторів мітохондріальної динаміки, біогенезу та мітозу у відповідь на лікування PPA. Ми кількісно визначили онкоген клітинної мієломи (cMYC), ядерний дихальний фактор (NRF1), мітохондріальний транскрипційний фактор 1 (TFAM), NFE2-подібний транскрипційний фактор BZIP (NFE2L2), гастрин-подібний білок 2 (STOML2), атрофію зорового нерва 1 (OPA1), мітофузин 1 (MFN1), мітофузин 2 (MFN2) та динамін-пов'язаний білок 1 (DRP1) після 24 годин обробки 3 мМ та 5 мМ PPA. Ми спостерігали обробку PPA у концентрації 3 мМ (p = 0,0053, p = 0,0415 та p < 0,0001 відповідно) та 5 мМ (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (рис. 3a–c). Зниження експресії мРНК було дозозалежним: експресія cMYC, NRF1 та TFAM зменшилася в 5,7, 2,6 та 1,9 раза при 3 мМ відповідно, та в 11,2, 3 та 2,2 раза при 5 мМ. Навпаки, центральний ген редокс-біогенезу NFE2L2 не змінювався при жодній концентрації PPA, хоча спостерігалася подібна дозозалежна тенденція зниження експресії (рис. 3d).
Ми також дослідили експресію класичних генів, що беруть участь у регуляції поділу та злиття. Вважається, що STOML2 бере участь у злитті, мітофагії та біогенезі, і його експресія була значно знижена (p < 0,0001) при 3 мМ (зміна в 2,4 раза) та 5 мМ (зміна в 2,8 раза) PPA (рис. 1). 3d). Аналогічно, експресія гена злиття OPA1 була знижена при 3 мМ (зміна в 1,6 раза) та 5 мМ (зміна в 1,9 раза) PPA (p = 0,006 та p = 0,0024 відповідно) (рис. 3f). Однак ми не виявили суттєвих відмінностей в експресії генів злиття MFN1, MFN2 або гена поділу DRP1 під 24-годинним стресом PPA (рис. 3g–i). Крім того, ми виявили, що рівні чотирьох білків злиття та поділу (OPA1, MFN1, MFN2 та DRP1) не змінювалися за тих самих умов (рис. 4a–d). Важливо зазначити, що ці дані відображають єдиний момент часу та можуть не відображати змін в експресії білків або рівнях активності на ранніх стадіях стресу PPA. Однак значне зниження експресії cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 та OPA1 вказує на значну транскрипційну дисрегуляцію мітохондріального метаболізму, біогенезу та динаміки. Крім того, ці дані підкреслюють корисність методів візуалізації для безпосереднього вивчення кінцевих змін функції мітохондрій.
Рівні білків факторів злиття та поділу не змінилися після обробки пропіоновою кислотою (PPA). Клітини SH-SY5Y обробляли 3 та 5 мМ PPA протягом 24 годин. Рівні білка були кількісно визначені за допомогою вестерн-блот аналізу, а рівні експресії нормалізовані до загального білка. Показано середню експресію білка та репрезентативні вестерн-блоти цільового та загального білка. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Стовпчики представляють середнє ± SEM, а показані дані є репрезентативними для n = 3 біологічних повторностей. Множинні порівняння (p < 0,05) були проведені за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу та тесту Даннета. Вихідний гель та блот показані на рисунку S1.
Мітохондріальна дисфункція пов'язана з мультисистемними захворюваннями, починаючи від метаболічних, серцево-судинних та м'язових до неврологічних1,10. Багато нейродегенеративних та нейродегенеративних захворювань пов'язані з мітохондріальною дисфункцією, що підкреслює важливість цих органел протягом усього життя мозку. Ці захворювання включають хворобу Паркінсона, хворобу Альцгеймера та розлад аутистичного спектру3,4,18. Однак доступ до тканини мозку для вивчення цих захворювань є складним, особливо на механістичному рівні, що робить клітинні модельні системи необхідною альтернативою. У цьому дослідженні ми використовуємо клітинну модельну систему з використанням клітин SH-SY5Y, оброблених PPA, для рекапітуляції мітохондріальної дисфункції, що спостерігається при нейрональних захворюваннях, зокрема розладах аутистичного спектру. Використання цієї моделі PPA для вивчення динаміки мітохондрій у нейронах може дати уявлення про етіологію РАС.
Ми дослідили можливість використання ПЕМ для спостереження за змінами морфології мітохондрій. Важливо зазначити, що ПЕМ необхідно використовувати правильно для максимальної ефективності. Підготовка кріозразків дозволяє краще зберегти нейрональні структури, одночасно фіксуючи клітинні компоненти та зменшуючи утворення артефактів34. Відповідно до цього, ми спостерігали, що нейроноподібні клітини SH-SY5Y мали неушкоджені субклітинні органели та видовжені мітохондрії (рис. 1a). Це підкреслює корисність кріогенних методів підготовки для вивчення морфології мітохондрій у моделях нейрональних клітин. Хоча кількісні вимірювання є критично важливими для об'єктивного аналізу даних ПЕМ, досі немає єдиної думки щодо того, які конкретні параметри слід вимірювати для підтвердження морфологічних змін мітохондрій. На основі великої кількості досліджень, які кількісно досліджували морфологію мітохондрій17,31,32, ми розробили автоматизований конвеєр аналізу мітохондріальних зображень, який вимірює вісім морфологічних параметрів, а саме: площу, площу², співвідношення сторін, периметр, округлість, градус , діаметр Фере та округлість.
Серед них PPA значно зменшив площу 2, площу, периметр та діаметр Фере (рис. 1b–e). Це показало, що мітохондрії стали меншими та більш округлими, що узгоджується з попередніми дослідженнями, які показали зменшення площі мітохондрій після 72 годин мітохондріального стресу, індукованого PPA30. Ці морфологічні особливості можуть свідчити про поділ мітохондрій, необхідний процес для секвестру пошкоджених компонентів з мітохондріальної мережі з метою сприяння їх деградації через мітофагію35,36,37. З іншого боку, зменшення середнього розміру мітохондрій може бути пов'язане зі збільшенням біогенезу, що призводить до утворення малих мітохондрій, що зароджуються. Збільшення поділу або біогенезу являє собою компенсаторну реакцію для підтримки мітозозу проти мітохондріального стресу. Однак не можна виключати зниження росту мітохондрій, порушення злиття або інші стани.
Хоча зображення високої роздільної здатності, створені за допомогою TEM, дозволяють визначати морфологічні характеристики на рівні окремих мітохондрій, цей метод створює двовимірні знімки в один момент часу. Для вивчення динамічних реакцій на метаболічний стрес ми забарвлювали мітохондрії за допомогою TMRE та використовували покадрову мікроскопію з MEL-аналізом, що дозволяє високопродуктивну 3D-візуалізацію змін у мітохондріальній мережі з часом33,38. Ми спостерігали незначні, але значні зміни в динаміці мітохондрій під впливом PPA-стресу (рис. 2). При 3 мМ кількість подій поділу значно збільшилася, тоді як події злиття залишилися такими ж, як і в контролі. Збільшення кількості як подій поділу, так і злиття спостерігалося при 5 мМ PPA, але ці зміни були приблизно пропорційними, що свідчить про те, що кінетика поділу та злиття досягає рівноваги при вищих концентраціях (рис. 2b). Середній об'єм мітохондрій залишався незмінним як при 3, так і при 5 мМ PPA, що свідчить про збереження цілісності мітохондріальної мережі (рис. 2d). Це відображає здатність динамічних мітохондріальних мереж реагувати на легкий метаболічний стрес, щоб ефективно підтримувати гомеостаз, не викликаючи фрагментації мережі. При 3 мМ PPA збільшення поділу є достатнім для сприяння переходу до нової рівноваги, але у відповідь на стрес, викликаний вищими концентраціями PPA, потрібна глибша кінетична ремоделювання.
Кількість мітохондрій збільшилася при обох концентраціях стресу PPA, але середній об'єм мітохондрій суттєво не змінився (рис. 2c). Це може бути пов'язано зі збільшенням біогенезу або збільшенням поділу; однак, за відсутності значного зменшення середнього об'єму мітохондрій, більш імовірно, що біосинтез збільшується. Однак дані на рисунку 2 підтверджують існування двох компенсаторних механізмів: збільшення кількості подій поділу, що узгоджується з підвищенням регуляції мітохондріального поділу, та збільшення кількості подій, що узгоджується з мітохондріальним біогенезом. Зрештою, динамічна компенсація легкого стресу може складатися з одночасних процесів, що включають поділ, злиття, біогенез та мітофагію. Хоча попередні автори показали, що PPA посилює мітоз30,39 та мітофагію29, ми надаємо докази ремоделювання динаміки мітохондріального поділу та злиття у відповідь на PPA. Ці дані підтверджують морфологічні зміни, що спостерігаються за допомогою TEM, та надають подальше розуміння механізмів, пов'язаних з мітохондріальною дисфункцією, індукованою PPA.
Оскільки ні TEM, ні MEL-аналіз не дали прямих доказів механізмів регуляції генів, що лежать в основі спостережуваних морфологічних змін, ми дослідили експресію РНК генів, задіяних у мітохондріальному метаболізмі, біогенезі та динаміці. Протоонкоген cMYC є транскрипційним фактором, що бере участь у регуляції мітохондрій, гліколізу, метаболізму амінокислот та жирних кислот40. Крім того, відомо, що cMYC регулює експресію майже 600 мітохондріальних генів, задіяних у мітохондріальній транскрипції, трансляції та складанні комплексів, включаючи NRF1 та TFAM41. NRF1 та TFAM є двома центральними регуляторами мітозозу, що діють нижче за течією від PGC-1α для активації реплікації мтДНК. Цей шлях активується сигналізацією цАМФ та AMPK і чутливий до витрат енергії та метаболічного стресу. Ми також дослідили NFE2L2, окисно-відновний регулятор мітохондріального біогенезу, щоб визначити, чи можуть ефекти PPA бути опосередковані оксидативним стресом.
Хоча експресія NFE2L2 залишалася незмінною, ми виявили послідовне дозозалежне зниження експресії cMYC, NRF1 та TFAM після 24 годин обробки 3 мМ та 5 мМ PPA (рис. 3a–c). Зниження експресії cMYC раніше повідомлялося як відповідь на мітохондріальний стрес42, і навпаки, зниження експресії cMYC може спричинити мітохондріальну дисфункцію шляхом ремоделювання мітохондріального метаболізму, мережевої зв'язності та поляризації мембран43. Цікаво, що cMYC також бере участь у регуляції мітохондріального поділу та злиття42,43 і, як відомо, збільшує фосфорилювання DRP1 та локалізацію мітохондрій під час поділу клітин44, а також опосередковує морфологічне ремоделювання мітохондрій у нейрональних стовбурових клітинах45. Дійсно, фібробласти з дефіцитом cMYC демонструють зменшений розмір мітохондрій, що узгоджується зі змінами, викликаними стресом PPA43. Ці дані ілюструють цікавий, але поки що незрозумілий зв'язок між cMYC та динамікою мітохондрій, що є цікавою мішенню для майбутніх досліджень ремоделювання, індукованого стресом PPA.
Зниження NRF1 та TFAM узгоджується з роллю cMYC як важливого транскрипційного активатора. Ці дані також узгоджуються з попередніми дослідженнями на клітинах раку товстої кишки людини, які показали, що PPA знижує експресію мРНК NRF1 через 22 години, що пов'язано з виснаженням АТФ та збільшенням ROS46. Ці автори також повідомили, що експресія TFAM збільшувалася через 8,5 години, але поверталася до вихідного рівня через 22 години. На противагу цьому, Kim et al. (2019) показали, що експресія мРНК TFAM значно знижувалася після 4 годин стресу PPA в клітинах SH-SY5Y; однак, через 72 години експресія білка TFAM значно збільшувалася, а кількість копій мтДНК значно збільшувалася. Таким чином, зменшення кількості генів мітохондріального біогенезу, яке ми спостерігали через 24 години, не виключає можливості того, що збільшення кількості мітохондрій пов'язане з активацією біогенезу в більш ранні моменти часу. Попередні дослідження показали, що PPA значно підвищує рівень мРНК та білка PGC-1α в клітинах SH-SY5Y через 4 години 30 хвилин, тоді як пропіонова кислота посилює мітохондріальний біогенез у гепатоцитах теляти через PGC-1α через 12 годин 39 хвилин. Цікаво, що PGC-1α є не тільки прямим транскрипційним регулятором NRF1 та TFAM, але також було показано, що він регулює активність MFN2 та DRP1 шляхом регулювання поділу та злиття47. У сукупності це підкреслює тісний зв'язок механізмів, що регулюють мітохондріальні компенсаторні реакції, індуковані PPA. Більше того, наші дані відображають значну дисрегуляцію транскрипційної регуляції біогенезу та метаболізму під впливом PPA.
Гени STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 та DRP1 є одними з центральних регуляторів мітохондріального поділу, злиття та динаміки37,48,49. Існує багато інших генів, задіяних у мітохондріальній динаміці, проте раніше було виявлено, що STOML2, OPA1 та MFN2 диференційно метильовані в когортах з РАС16, і кілька незалежних досліджень повідомляли про зміни цих транскрипційних факторів у відповідь на мітохондріальний стрес50,51.52. Експресія як OPA1, так і STOML2 була значно знижена після обробки 3 мМ та 5 мМ PPA (рис. 3e, f). OPA1 є одним з класичних регуляторів мітохондріального злиття через пряму взаємодію з MFN1 та 2 і відіграє роль у ремоделюванні крист та морфології мітохондрій53. Точна роль STOML2 у мітохондріальній динаміці залишається неясною, але дані свідчать про те, що він відіграє роль у мітохондріальному злитті, біогенезі та мітофагії.
STOML2 бере участь у підтримці мітохондріального дихального зв'язку та утворенні комплексів дихального ланцюга54,55, і, як було показано, він суттєво змінює метаболічні характеристики ракових клітин56. Дослідження показали, що STOML2 сприяє потенціалу мітохондріальної мембрани та біогенезу шляхом взаємодії з BAN та кардіоліпіном55, 57, 58. Крім того, незалежні дослідження показали, що взаємодія між STOML2 та PINK1 регулює мітофагію59,60. Примітно, що, як повідомлялося, STOML2 безпосередньо взаємодіє з MFN2 та стабілізує його, а також відіграє важливу роль у стабілізації довгих ізоформ OPA1 шляхом інгібування протеази, відповідальної за деградацію OPA153,61,62. Зниження експресії STOML2, що спостерігається в реакціях PPA, може зробити ці білки злиття більш схильними до деградації через убіквітин- та протеасом-залежні шляхи48. Хоча точна роль STOML2 та OPA1 у динамічній відповіді на PPA неясна, знижена експресія цих генів злиття (Рисунок 3) може порушити баланс між поділом та злиттям і призвести до зменшення розміру мітохондрій (Рисунок 3). 1).
З іншого боку, експресія білка OPA1 залишалася незмінною через 24 години, тоді як рівні мРНК та білка MFN1, MFN2 або DRP1 суттєво не змінилися після обробки PPA (рис. 3g-i, рис. 4). Це може свідчити про відсутність змін у регуляції цих факторів, що беруть участь у мітохондріальному злитті та поділі. Однак варто зазначити, що кожен із цих чотирьох генів також регулюється посттранскрипційними модифікаціями (PTM), які контролюють активність білка. OPA1 має вісім альтернативних варіантів сплайсингу, які протеолітично розщеплюються в мітохондріях, утворюючи дві різні ізоформи 63. Баланс між довгими та короткими ізоформами зрештою визначає роль OPA1 у мітохондріальному злитті та підтримці мітохондріальної мережі 64. Активність DRP1 регулюється фосфорилюванням кальцій/кальмодулінзалежної протеїнкінази II (CaMKII), тоді як деградація DRP1 регулюється убиквітинірованням та SUMOylation 65. Зрештою, як DRP1, так і MFN1/2 є ГТФазами, тому на активність може впливати швидкість продукування ГТФ у мітохондріях 66. Тому, хоча експресія цих білків залишається постійною, це може не відображати незмінну активність або локалізацію білка 67,68. Дійсно, існуючі репертуари білків PTM часто служать першою лінією захисту, відповідальною за опосередкування гострих стресових реакцій. За наявності помірного метаболічного стресу в нашій моделі ймовірно, що PTM сприяє підвищеній активності білків злиття та поділу для достатнього відновлення цілісності мітохондрій без необхідності додаткової активації цих генів на рівні мРНК або білка.
У сукупності вищезазначені дані підкреслюють складну та залежну від часу регуляцію мітохондріальної морфології та труднощі, пов'язані з поясненням цих механізмів. Для вивчення експресії генів спочатку необхідно ідентифікувати специфічні гени-мішені в цьому шляху. Однак наші дані показують, що гени в одному й тому ж шляху не реагують однаково на один і той самий стрес. Фактично, попередні дослідження показали, що різні гени в одному й тому ж шляху можуть демонструвати різні профілі часових реакцій30,46. Крім того, існують складні посттранскрипційні механізми, які порушують зв'язок між транскрипцією та функцією генів. Протеомні дослідження можуть дати уявлення про вплив посттранскрипційних тканин та функції білка, але вони також створюють труднощі, включаючи низькопродуктивні методи, високе співвідношення сигнал/шум та низьку роздільну здатність.
У цьому контексті вивчення морфології мітохондрій за допомогою TEM та MEL має великий потенціал для вирішення фундаментальних питань щодо взаємозв'язку між динамікою та функцією мітохондрій та того, як це впливає на захворювання. Найголовніше, що TEM забезпечує прямий метод вимірювання морфології мітохондрій як конвергентної кінцевої точки мітохондріальної дисфункції та динаміки51. MEL також забезпечує прямий метод візуалізації подій поділу та злиття в тривимірному клітинному середовищі, що дозволяє кількісно визначити динамічне ремоделювання мітохондрій навіть за відсутності змін в експресії генів33. Тут ми підкреслюємо корисність методів візуалізації мітохондрій при вторинних мітохондріальних захворюваннях. Ці захворювання зазвичай характеризуються хронічним легким метаболічним стресом, що характеризується тонким ремоделюванням мітохондріальних мереж, а не гострим пошкодженням мітохондрій. Однак мітохондріальна компенсація, необхідна для підтримки мітозозу при хронічному стресі, має глибокі функціональні наслідки. У контексті нейронауки краще розуміння цих компенсаторних механізмів може надати важливу інформацію про плейотропну нейропатологію, пов'язану з мітохондріальною дисфункцією.
Зрештою, наші дані підкреслюють корисність методів візуалізації для розуміння функціональних наслідків складних взаємодій між експресією генів, модифікаціями білків та активністю білків, що контролюють динаміку нейрональних мітохондрій. Ми використовували PPA для моделювання мітохондріальної дисфункції в моделі нейрональних клітин, щоб отримати уявлення про мітохондріальний компонент ASD. Клітини SH-SY5Y, оброблені PPA, показали зміни в морфології мітохондрій: мітохондрії стали маленькими та круглими, а кристи були погано визначені при спостереженні за допомогою TEM. Аналіз MEL показує, що ці зміни відбуваються одночасно зі збільшенням подій поділу та злиття для підтримки мітохондріальної мережі у відповідь на легкий метаболічний стрес. Крім того, PPA значно порушує транскрипційну регуляцію мітохондріального метаболізму та гомеостазу. Ми ідентифікували cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 та OPA1 як ключові мітохондріальні регулятори, порушені стресом PPA, і можуть відігравати роль у опосередкуванні змін морфології та функції мітохондрій, індукованих PPA. Необхідні подальші дослідження, щоб краще охарактеризувати індуковані PPA часові зміни в експресії генів та активності білків, локалізації та посттрансляційних модифікаціях. Наші дані підкреслюють складність та взаємозалежність регуляторних механізмів, що опосередковують реакцію мітохондрій на стрес, та демонструють корисність ПЕМ та інших методів візуалізації для більш цілеспрямованих механістичних досліджень.
Лінію клітин SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) було придбано у Sigma-Aldrich. Клітини SH-SY5Y вирощували у модифікованому середовищі Ігла Дульбекко/поживній суміші F-12 (DMEM/F-12) та L-глутаміну (SC09411, ScienCell) у колбах об'ємом 25 см², доповнених 20% фетальною бичачою сироваткою (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) та 1% пеніциліну-стрептоміцину (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) при 37 °C, 5% CO². Клітини субкультивували до 80% конфлюентності з використанням 0,05% трипсину-ЕДТА (15400054, ThermoFisher Scientific), центрифугували при 300 g та висівали при щільності приблизно 7 × 105 клітин/мл. Усі експерименти проводили на недиференційованих клітинах SH-SY5Y між пасажами 19–22. PPA вводять у вигляді NaP. Розчиняють порошок NaP (CAS № 137-40-6, хімічна формула C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) у теплій воді MilliQ до концентрації 1 M та зберігають при 4 °C. У день обробки розводять цей розчин 1 M PPA до 3 mM та 5 mM PPA у безсиворотковому середовищі (DMEM/F-12 з L-глутаміном). Концентрації обробки для всіх експериментів були без PPA (0 mM, контроль), 3 mM та 5 mM PPA. Експерименти проводили щонайменше у трьох біологічних повторностях.
Клітини SH-SY5Y висівали в колби об'ємом 25 см5 зі швидкістю 5,5 × 105 клітин/мл та вирощували протягом 24 годин. Обробку PPA додавали в колбу перед 24-годинною інкубацією. Збирали клітинні осади, дотримуючись звичайних протоколів субкультивування тканин ссавців (описаних вище). Ресуспендували клітинний осад у 100 мкл 2,5% глутаральдегіду, 1× PBS, та зберігали при 4°C до обробки. Клітини SH-SY5Y короткочасно центрифугували для осаду клітин та видалення 2,5% розчину глутаральдегіду, 1× PBS. Ресуспендували осад у 4% агарозному гелі, приготованому в дистильованій воді (співвідношення об'єму агарози до об'єму осаду становить 1:1). Шматочки агарози розміщували на сітках на плоских пластинах та покривали 1-гексадеценом перед заморожуванням під високим тиском. Зразки заморожували у 100% сухому ацетоні при -90°C протягом 24 годин. Потім температуру підвищили до -80°C та додали розчин 1% чотириоксиду осмію та 0,1% глутаральдегіду. Зразки зберігали при -80°C протягом 24 годин. Після цього температуру поступово підвищували до кімнатної температури протягом кількох днів: від –80°C до –50°C протягом 24 годин, до –30°C протягом 24 годин, до –10°C протягом 24 годин і, нарешті, до кімнатної температури.
Після кріогенної підготовки зразки просочували смолою, і ультратонкі зрізи (∼100 нм) виготовляли за допомогою ультрамікротома Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Зрізи забарвлювали 2% розчином уранілацетату та цитрату свинцю. Зразки спостерігали за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (раніше FEI), Ейндховен, Нідерланди), що працює на напрузі 200 кВ (передавач Lab6), та ПЗС-камери Gatan (Gatan, Велика Британія), оснащеної енергетичним фільтром Tridiem.
У кожному технічному повторенні було отримано щонайменше 24 зображення окремих клітин, загалом 266 зображень. Усі зображення аналізували за допомогою макросу області інтересу (ROI) та макросу мітохондрій. Мітохондріальний макрос базується на опублікованих методах17,31,32 та дозволяє напівавтоматизовану пакетну обробку зображень TEM у Fiji/ImageJ69. Коротко кажучи: зображення інвертується та інвертується за допомогою віднімання фону котячої кулі (радіус 60 пікселів) та смугового фільтра FFT (з використанням верхньої та нижньої меж 60 та 8 пікселів відповідно) та придушення вертикальних ліній з допуском орієнтації 5%. Оброблене зображення автоматично обмежується порогом за допомогою алгоритму максимальної ентропії, і генерується бінарна маска. Були вилучені області зображення, пов'язані з вибраними вручну ROI на необроблених зображеннях TEM, що характеризують мітохондрії та виключають плазматичну мембрану та інші області з високим контрастом. Для кожної видобутої області інтересу (ROI) аналізували бінарні частинки розміром понад 600 пікселів, а площу частинок, периметр, велику та малу осі, діаметр Фере, округлість та круговість вимірювали за допомогою вбудованих функцій вимірювання Fiji/ImageJ. Згідно з Merrill, Flippo та Strack (2017), на основі цих даних розраховували площу 2, співвідношення сторін частинок (співвідношення великої та малої осей) та коефіцієнт форми (FF), де FF = периметр 2/4π x площа. Визначення параметричної формули можна знайти у Merrill, Flippo та Strack (2017). Згадані макроси доступні на GitHub (див. Заяву про доступність даних). В середньому на одну обробку PPA аналізували приблизно 5600 частинок, загалом приблизно 17 000 частинок (дані не показані).
Клітини SH-SH5Y поміщали у 8-камерні культуральні чашки (ThermoFisher, #155411) для забезпечення адгезії протягом ночі, а потім інкубували з TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) та Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Зображення отримували за допомогою лазерів 405 нм та 561 нм протягом 10 хвилин, а необроблені зображення отримували у вигляді z-стеків, що містять 10 мікрофотографій зображень з кроком az 0,2 мкм між кадрами зображення у 12 послідовних часових точках. Зображення збирали за допомогою платформи надвисокої роздільної здатності Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Оберкохен, Німеччина) з використанням об'єктива LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Зображення аналізували в ImageJ за допомогою раніше описаного конвеєра та плагіна ImageJ для вимірювання подій злиття та поділу, середньої кількості мітохондріальних структур та середнього об'єму мітохондрій на клітину33. Макроси MEL доступні на GitHub (див. Заяву про доступність даних).
Клітини SH-SY5Y вирощували в шестилункових планшетах при щільності 0,3 × 10⁶ клітин/мл протягом 24 годин перед обробкою. РНК екстрагували за протоколом Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) з незначними модифікаціями: додавали 300 мкл буфера для лізису РНК у кожну лунку перед видаленням та лізували кожен зразок на завершальному етапі 30 мкл води, вільної від ДНКази/РНКази для елюції. Всі зразки перевіряли на кількість та якість за допомогою УФ-спектрофотометра NanoDrop ND-1000. Загальний білок з клітинних лізатів отримували за допомогою 200 мкл буфера для лізису RIPA, а концентрацію білка кількісно визначали за допомогою аналізу Бредфорда на білок70.
Синтез кДНК проводили за допомогою набору для синтезу кДНК Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) згідно з інструкціями виробника з деякими модифікаціями. кДНК синтезували в реакціях об'ємом 20 мкл, використовуючи від 0,7 до 1 мкг загальної РНК. Праймери були обрані з раніше опублікованих статей 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Таблиця S1), а супровідні зонди були розроблені за допомогою інструменту PrimerQuest від Integrated DNA Technologies. Всі гени, що цікавлять, були нормалізовані відносно ядерного гена B2M. Експресію генів STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC та OPA1 вимірювали за допомогою RT-qPCR. Мастер-мікс включав полімеразу LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ прямих та зворотних праймерів, кДНК та воду, придатну для ПЛР, для отримання кінцевого об'єму 10 мкл для кожної реакції. Експресію генів поділу та ділення (DRP1, MFN1/2) вимірювали за допомогою мультиплексного аналізу TaqMan. Майстер-мікс Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) використовували згідно з інструкціями виробника з незначними модифікаціями. Мультиплексний майстер-мікс для зворотної транскрипції (RT-qPCR) включає 1X LUNA Taq полімеразу, 10 мкМ прямих та зворотних праймерів, 10 мкМ зонда, кДНК та воду ПЛР-класу, що призводить до кінцевого об'єму 20 мкл для кожної реакції. RT-qPCR проводили за допомогою Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — серійний номер: R0618110). Умови циклу наведено в таблиці S1. Всі зразки кДНК ампліфікували у трьох повторностях, а стандартну криву побудували за допомогою серії десятикратних розведень. Викиди у трьох повторностях зразків зі стандартним відхиленням порогу циклу (Ct) > 0,5 видаляли з аналізу для забезпечення відтворюваності даних30,72. Відносну експресію генів розраховували за допомогою методу 2-ΔΔCt79.
Зразки білка (60 мкг) змішували з буфером для завантаження Леммлі у співвідношенні 2:1 та аналізували на 12% безбарвному білковому гелі (Bio-Rad #1610184). Білки переносили на мембрану PVDF (полівініліденфторид) (#170-84156, Bio-Rad) за допомогою системи Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Мембрану блокували та інкубували з відповідними первинними антитілами (OPA1, MFN1, MFN2 та DRP1) (розведеними 1:1000) протягом 48 годин, а потім інкубували з вторинними антитілами (1:10 000) протягом 1 години. Потім мембрани візуалізували за допомогою субстрату Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) та реєстрували за допомогою системи Bio-Rad ChemiDoc MP. Для вестерн-блот аналізу використовували ImageLab версії 6.1. Вихідний гель та блот показано на рисунку S1. Інформація про антитіла наведена в таблиці S2.
Набори даних представлені як середнє значення та стандартна похибка середнього значення (SEM) щонайменше трьох незалежних вибірок. Набори даних були перевірені на нормальність за допомогою тесту Шапіро-Вілкса (якщо не зазначено інше), перш ніж припустити розподіл Гауса та рівні стандартні відхилення та продовжити аналіз. На додаток до аналізу набору даних, для визначення значущості (p < 0,05) було використано MEL LSD Фішера, однофакторний дисперсійний аналіз (середнє значення лікування проти контролю) та тест множинних порівнянь Даннета. Значущі значення p показані на графіку як *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Всі статистичні аналізи та графіки були виконані та згенеровані за допомогою GraphPad Prism 9.4.0.
Макроси Fiji/ImageJ для аналізу зображень TEM загальнодоступні на GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макрос Mitochondrial Event Locator (MEL) загальнодоступний на GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейліана А., Деві Н.М. та Віджая А. Мітохондрії: головні регулятори метаболізму, гомеостазу, стресу, старіння та епігенетики. Індонезійська. Біомедична наука. Журнал 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Багатогранна мітохондріальна дисфункція при шизофренії, комплекс I як можлива патологічна мішень. Шизофренія. ресурс. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. та Біл, М. Ф. Мітохондріальна дисфункція при хворобі Паркінсона. Журнал нейрохімії. 139, 216–231 (2016).
Шарма В.К., Сінгх Т.Г. та Мехта В. Стресовані мітохондрії: мішені інвазії при хворобі Альцгеймера. Мітохондрії 59, 48–57 (2021).
Беленгер П., Дуарте ЖМН, Шук П.Ф. та Феррейра Г.К. Мітохондрії та мозок: біоенергетика та інше. Нейротоксини. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Рангараджу, В. та ін. Плейотропні мітохондрії: вплив мітохондрій на розвиток нейронів та захворювання. Журнал нейронауки. 39, 8200–8208 (2019).
Карданьо-Рамос, К. та Мораїс, В.А. Мітохондріальний біогенез у нейронах: як і де. Інтернаціональність. Дж. Мор. Наука. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Ністер, М. та Чжао, Дж. Регуляція динаміки мітохондрій ссавців: можливості та проблеми. Фронт. ендокринний. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. та Слек, Р.С. Мітохондріальна динаміка в регуляції нейрогенезу: від мозку, що розвивається, до мозку дорослого. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).