Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Наночастинки (НЧ) інсуліну з високим вмістом завантаження знайшли різні застосування в різних лікарських формах. Ця робота спрямована на оцінку впливу процесів ліофілізації та розпилювальної сушки на структуру наночастинок хітозану, завантажених інсуліном, з манітолом як кріопротектором або без нього. Ми також оцінили якість цих наночастинок шляхом їх повторного розчинення. Перед дегідратацією розмір частинок зшитих наночастинок хітозан/триполіфосфат натрію/інсулін був оптимізований до 318 нм, PDI становив 0,18, ефективність інкапсуляції становила 99,4%, а завантаження становило 25,01%. Після відновлення всі наночастинки, крім тих, що були отримані методом ліофілізації без використання манітолу, зберегли свою сферичну структуру частинок. Порівняно з наночастинками, що містять маніт, зневодненими будь-яким розпиленням, наночастинки, висушені розпиленням без манітолу, також показали найменший середній розмір частинок (376 нм) та найвищий вміст завантаження (25,02%) з подібною швидкістю інкапсуляції (98,7%) та PDI. (0,20) методом сушіння або ліофілізаційного сушіння. Висушені наночастинки методом розпилювального сушіння без манітолу також призвели до найшвидшого вивільнення інсуліну та найвищої ефективності клітинного поглинання. Ця робота показує, що розпилювальне сушіння може зневоднювати наночастинки інсуліну без потреби в кріопротекторах порівняно зі звичайними методами ліофілізаційного сушіння, створюючи значну перевагу в більшій ємності завантаження, нижчих вимогах до добавок та експлуатаційних витратах.
З моменту свого відкриття в 1922 році1,2,3 інсулін та його фармацевтичні препарати рятували життя пацієнтів з діабетом 1 типу (ЦД1) та діабетом 2 типу (ЦД1). Однак, завдяки своїм властивостям високомолекулярного білка, інсулін легко агрегується, розщеплюється протеолітичними ферментами та виводиться шляхом ефекту першого проходження. Людям з діагнозом діабету 1 типу необхідні ін'єкції інсуліну до кінця життя. Багатьом пацієнтам, у яких спочатку діагностовано діабет 2 типу, також потрібні тривалі ін'єкції інсуліну. Щоденні ін'єкції інсуліну є серйозним джерелом щоденного болю та дискомфорту для цих людей, що негативно впливає на психічне здоров'я. Як результат, інші форми введення інсуліну, які викликають менший дискомфорт, такі як пероральне введення інсуліну, широко вивчаються5, оскільки вони мають потенціал для відновлення якості життя приблизно 5 мільярдів людей з діабетом у всьому світі.
Технологія наночастинок забезпечила значний прогрес у спробах приймати пероральний інсулін4,6,7. Такий, що ефективно інкапсулює та захищає інсулін від деградації для цільової доставки до певних ділянок тіла. Однак використання наночастинок має кілька обмежень, головним чином через проблеми стабільності суспензій частинок. Під час зберігання може відбуватися деяка агрегація, що знижує біодоступність наночастинок, завантажених інсуліном8. Крім того, для забезпечення стабільності наночастинок (НЧ) інсуліну також необхідно враховувати хімічну стабільність полімерної матриці наночастинок та інсуліну. Наразі технологія ліофілізації є золотим стандартом для створення стабільних НЧ, запобігаючи небажаним змінам під час зберігання9.
Однак, ліофілізація вимагає додавання кріопротекторів, щоб запобігти впливу механічного навантаження кристалів льоду на сферичну структуру наночастинок. Це значно зменшує завантаження наночастинок інсуліну після ліофілізації, оскільки кріопротектор займає більшу частину вагової частки. Тому отримані наночастинки інсуліну часто виявляються непридатними для виготовлення сухих порошкових препаратів, таких як таблетки для перорального застосування та плівки для перорального застосування, через необхідність великої кількості сухих наночастинок для досягнення терапевтичного вікна інсуліну.
Розпилювальне сушіння – це добре відомий і недорогий промисловий процес виробництва сухих порошків з рідких фаз у фармацевтичній промисловості10,11. Контроль над процесом формування частинок дозволяє належним чином інкапсулювати кілька біоактивних сполук12,13. Крім того, воно стало ефективним методом приготування інкапсульованих білків для перорального застосування. Під час розпилювального сушіння вода дуже швидко випаровується, що допомагає підтримувати низьку температуру ядра частинок11,14, що дозволяє його наносити для інкапсуляції термочутливих компонентів. Перед розпилювальним сушінням матеріал покриття слід ретельно гомогенізувати з розчином, що містить інкапсульовані інгредієнти11,14. На відміну від ліофілізаційного сушіння, гомогенізація перед інкапсуляцією при розпилювальному сушінні покращує ефективність інкапсуляції під час дегідратації. Оскільки процес інкапсуляції розпилювальним сушінням не вимагає кріопротекторів, розпилювальне сушіння можна використовувати для отримання висушених наночастинок з високим вмістом завантаження.
У цьому дослідженні повідомляється про отримання наночастинок, завантажених інсуліном, шляхом зшивання хітозану та триполіфосфату натрію з використанням методу іонного гелю. Іонне гелювання – це метод отримання, який дозволяє отримувати наночастинки шляхом електростатичних взаємодій між двома або більше іонними видами за певних умов. Для дегідратації оптимізованих зшитих наночастинок хітозан/триполіфосфат натрію/інсулін використовували як методи ліофілізації, так і розпилювальної сушіння. Після дегідратації їх морфологію аналізували за допомогою скануючої електронної мікроскопії (СЕМ). Їхню рекомбінаційну здатність оцінювали шляхом вимірювання розподілу розмірів, поверхневого заряду, PDI, ефективності інкапсуляції та вмісту завантаження. Якість повторно розчинених наночастинок, отриманих різними методами дегідратації, також оцінювали шляхом порівняння їхнього захисту від інсуліну, поведінки вивільнення та ефективності клітинного поглинання.
pH змішаного розчину та співвідношення хітозану та інсуліну є двома ключовими факторами, що впливають на розмір частинок та ефективність інкапсуляції (ЕЕ) кінцевих наночастинок, оскільки вони безпосередньо впливають на процес іонотропного гелеутворення. Було показано, що pH змішаного розчину тісно корелює з розміром частинок та ефективністю інкапсуляції (рис. 1a). Як показано на рис. 1a, зі збільшенням pH від 4,0 до 6,0 середній розмір частинок (нм) зменшувався, а ЕЕ значно збільшувалася, тоді як при збільшенні pH до 6,5 середній розмір частинок починав збільшуватися, а ЕЕ залишалася незмінною. Зі збільшенням співвідношення хітозану до інсуліну також збільшується середній розмір частинок. Крім того, жодних змін ЕЕ не спостерігалося, коли наночастинки готували при масовому співвідношенні хітозан/інсулін вище 2,5:1 (мас./мас.) (рис. 1b). Тому для приготування були використані оптимальні умови приготування в цьому дослідженні (pH 6,0, масове співвідношення хітозан/інсулін 2,5:1). наночастинки, завантажені інсуліном, для подальшого дослідження. За цих умов приготування середній розмір частинок наночастинок інсуліну був оптимізований до 318 нм (рис. 1c), PDI становив 0,18, ефективність вбудовування становила 99,4%, дзета-потенціал становив 9,8 мВ, а завантаження інсуліном становило 25,01% (м/м). На основі результатів просвічувальної електронної мікроскопії (ТЕМ) оптимізовані наночастинки були приблизно сферичними та дискретними з відносно однорідним розміром (рис. 1d).
Оптимізація параметрів наночастинок інсуліну: (a) вплив pH на середній діаметр та ефективність інкапсуляції (ЕЕ) наночастинок інсуліну (приготованих при масовому співвідношенні хітозану та інсуліну 5:1); (b) хітозан та вплив масового співвідношення інсуліну на середній діаметр та ефективність інкапсуляції (ЕЕ) наночастинок інсуліну (приготованих при pH 6); (c) розподіл розмірів частинок оптимізованих наночастинок інсуліну; (d) мікрофотографія оптимізованих наночастинок інсуліну, отримана за допомогою просвічувальної електронної мікроскопії.
Загальновідомо, що хітозан є слабким поліелектролітом з pKa 6,5. Він позитивно заряджений у кислому середовищі, оскільки його основна аміногрупа протонована іонами водню15. Тому його часто використовують як носій для інкапсуляції негативно заряджених макромолекул. У цьому дослідженні хітозан використовували для інкапсуляції інсуліну з ізоелектричною точкою 5,3. Оскільки хітозан використовується як покривний матеріал, зі збільшенням його частки відповідно збільшується товщина зовнішнього шару наночастинок, що призводить до більшого середнього розміру частинок. Крім того, вищі рівні хітозану можуть інкапсулювати більше інсуліну. У нашому випадку EE була найвищою, коли співвідношення хітозану та інсуліну досягало 2,5:1, і не спостерігалося суттєвих змін EE, коли співвідношення продовжувало зростати.
Окрім співвідношення хітозану та інсуліну, pH також відігравав вирішальну роль у приготуванні наночастинок. Ган та ін.17 вивчали вплив pH на розмір частинок наночастинок хітозану. Вони виявили постійне зменшення розміру частинок, доки pH не досяг 6,0, а значне збільшення розміру частинок спостерігалося при pH > 6,0, що узгоджується з нашими спостереженнями. Це явище пов'язане з тим, що зі збільшенням pH молекула інсуліну набуває негативного поверхневого заряду, що сприяє електростатичній взаємодії з комплексом хітозан/триполіфосфат натрію (TPP), що призводить до малого розміру частинок та високої EE. Однак, коли pH було встановлено до 6,5, аміногрупи хітозану були депротоновані, що призводило до згортання хітозану. Таким чином, високий pH призводить до меншого впливу аміноіонів на TPP та інсулін, що призводить до меншого зшивання, більшого кінцевого середнього розміру частинок та нижчої EE.
Аналіз морфологічних властивостей ліофілізованих та розпилювально-сушених наночастинок може допомогти у виборі кращих методів дегідратації та формування порошку. Бажаний метод повинен забезпечувати стабільність препарату, однорідну форму частинок, високе завантаження препарату та добру розчинність у вихідному розчині. У цьому дослідженні, для кращого порівняння двох методів, під час дегідратації використовувалися наночастинки інсуліну з 1% манітолу або без нього. Манітол використовується як наповнювач або кріопротектор у різних сухих порошкових рецептурах для ліофілізації та розпилювальної сушіння. Для ліофілізованих наночастинок інсуліну без манітолу, як показано на рисунку 2a, під час скануючої електронної мікроскопії (СЕМ) спостерігалася високопориста структура порошку з великими, нерівними та шорсткими поверхнями. Після дегідратації в порошку було виявлено кілька дискретних частинок (рис. 2e). Ці результати вказують на те, що більшість наночастинок розкладалися під час ліофілізації без будь-якого кріопротектору. Для ліофілізованих та розпилювально-сушених наночастинок інсуліну, що містять 1% манітолу, спостерігалися сферичні наночастинки з гладкими поверхнями (рис. 2b,d,f,h). Наночастинки інсуліну, висушені розпиленням без манітолу, залишалися сферичними, але... зморшкуваті на поверхні (рис. 2c). Сферичні та зморшкуваті поверхні далі обговорюються в тестах на поведінку вивільнення та клітинне поглинання нижче. Виходячи з видимого вигляду висушених наночастинок, як розпилювально-сушені наночастинки без маніту, так і ліофілізовані та розпилювально-сушені з манітом наночастинки дали дрібні порошки наночастинок (рис. 2f,g,h). Чим більша площа поверхні між поверхнями частинок, тим вища розчинність і, отже, вища швидкість вивільнення.
Морфологія різних дегідратованих наночастинок інсуліну: (a) SEM-зображення ліофілізованих наночастинок інсуліну без маніту; (b) SEM-зображення ліофілізованих наночастинок інсуліну з манітом; (c) висушені розпиленням наночастинки інсуліну без маніту; SEM-зображення; (d) SEM-зображення висушених розпиленням наночастинок інсуліну з манітом; (e) зображення ліофілізованого порошку наночастинок інсуліну без маніту; (f) зображення ліофілізованих наночастинок інсуліну з манітом; (g) зображення висушених розпиленням порошку наночастинок інсуліну без маніту; (h) зображення висушених розпиленням порошку наночастинок інсуліну з манітом.
Під час ліофілізації маніт діє як кріопротектор, зберігаючи наночастинки в аморфній формі та запобігаючи пошкодженню кристалами льоду19. Натомість, під час розпилювального сушіння немає етапу заморожування. Тому маніт не потрібен у цьому методі. Фактично, розпилювально-сушені наночастинки без манітолу дали дрібніші наночастинки, як було описано раніше. Однак маніт все ще може діяти як наповнювач у процесі розпилювального сушіння, надаючи наночастинкам більш сферичної структури20 (рис. 2d), що допомагає досягти рівномірного вивільнення таких інкапсульованих наночастинок. Крім того, очевидно, що деякі великі частинки можна виявити як у ліофілізованих, так і в розпилювально-сушених наночастинках інсуліну, що містять маніт (рис. 2b,d), що може бути пов'язано з накопиченням манітолу в ядрі частинки разом з інкапсульованим інсуліном. Шар хітозану. Варто зазначити, що в цьому дослідженні, щоб забезпечити збереження сферичної структури після дегідратації, співвідношення манітолу та хітозану підтримується на рівні 5:1, завдяки чому велика кількість наповнювача також може збільшити розмір частинок висушених наночастинок.
Інфрачервона спектроскопія з повним ослабленим відбиттям Фур'є (FTIR-ATR) характеризувала фізичну суміш вільного інсуліну, хітозану, хітозану, TPP та інсуліну. Всі зневоднені наночастинки були охарактеризовані за допомогою FTIR-ATR спектроскопії. Примітно, що інтенсивність смуг 1641, 1543 та 1412 см-1 спостерігалася в інкапсульованих наночастинках, ліофілізованих з манітолом, та в наночастинках, сушених розпиленням з манітолом та без нього (рис. 3). Як повідомлялося раніше, це збільшення міцності було пов'язане зі зшиванням між хітозаном, TPP та інсуліном. Дослідження взаємодії між хітозаном та інсуліном показало, що в FTIR-спектрах наночастинок хітозану, завантажених інсуліном, смуга хітозану перекривалася зі смугою інсуліну, збільшуючи інтенсивність карбонільної (1641 см-1) та амінної (1543 см-1) смуги. Триполіфосфатні групи TPP пов'язані з амонієвими групами в хітозані, утворюючи смугу при 1412 см-1.
Спектри FTIR-ATR вільного інсуліну, хітозану, фізичних сумішей хітозан/TPP/інсулін та наночастинок, зневоднених різними методами.
Крім того, ці результати узгоджуються з результатами, отриманими за допомогою скануючої електронної мікроскопії (СЕМ), яка показала, що інкапсульовані наночастинки залишалися цілими як при розпиленні, так і при ліофілізації з манітолом, але за відсутності манітолу, лише розпилювальне сушіння давало інкапсульовані частинки. На противагу цьому, спектральні результати ІЧ-спектроскопії з перетворенням Фур'є-АТР для ліофілізованих наночастинок без манітолу були дуже схожими на фізичну суміш хітозану, трифосфату сульфату та інсуліну. Цей результат вказує на те, що зшивки між хітозаном, трифосфатом сульфату та інсуліном більше не присутні в ліофілізованих наночастинках без манітолу. Структура наночастинок була зруйнована під час ліофілізації без кріопротектора, що можна побачити в результатах СЕМ (рис. 2а). Виходячи з морфології та результатів ІЧ-спектроскопії зневоднених наночастинок інсуліну, для експериментів з відновлення використовувалися лише ліофілізовані, розпилювально-сушені та безманітні наночастинки, а безманітні наночастинки – через розкладання безманітних наночастинок під час дегідратації. Обговоріть.
Дегідратація використовується для тривалого зберігання та переробки в інші рецептури. Здатність сухих наночастинок (НЧ) до відновлення після зберігання є критично важливою для їх використання в різних рецептурах, таких як таблетки та плівки. Ми помітили, що середній розмір частинок висушених розпиленням НЧ інсуліну за відсутності манітолу збільшився лише незначно після відновлення. З іншого боку, розмір частинок висушених розпиленням та ліофілізованих наночастинок інсуліну з манітолом значно збільшився (Таблиця 1). PDI та EE суттєво не змінилися (p > 0,05) після рекомбінації всіх НЧ у цьому дослідженні (Таблиця 1). Цей результат вказує на те, що більшість частинок залишилися неушкодженими після повторного розчинення. Однак додавання манітолу призвело до значного зниження навантаження інсуліном ліофілізованих та висушених розпиленням наночастинок манітолу (Таблиця 1). Навпаки, вміст інсуліну в НЧ, висушених розпиленням без манітолу, залишився таким самим, як і раніше (Таблиця 1).
Загальновідомо, що завантаження наночастинок є критично важливим при використанні для доставки ліків. Для наночастинок з низьким навантаженням потрібна дуже велика кількість матеріалу для досягнення терапевтичного порогу. Однак висока в'язкість таких високих концентрацій наночастинок призводить до незручностей та труднощів при пероральному введенні та ін'єкційних препаратах відповідно 22. Крім того, наночастинки інсуліну також можна використовувати для виготовлення таблеток та в'язких біоплівок 23, 24, що вимагає використання великої кількості наночастинок при низьких рівнях навантаження, що призводить до великих таблеток та товстих біоплівок, які не підходять для перорального застосування. Тому зневоднені наночастинки з високим навантаженням інсуліну є дуже бажаними. Наші результати свідчать про те, що високе навантаження інсуліну в наночастинках, висушених розпиленням без манітолу, може запропонувати багато привабливих переваг для цих альтернативних методів доставки.
Усі зневоднені наночастинки зберігалися в холодильнику протягом трьох місяців. Результати скануючої електронної мікроскопії (СЕМ) показали, що морфологія всіх зневоднених наночастинок суттєво не змінилася протягом тримісячного зберігання (рис. 4). Після відновлення у воді всі наночастинки показали незначне зниження EE та вивільнили приблизно невелику кількість (~5%) інсуліну протягом тримісячного періоду зберігання (табл. 2). Однак середній розмір частинок усіх наночастинок збільшився. Розмір частинок наночастинок, висушених розпиленням без маніту, збільшився до 525 нм, тоді як розмір частинок наночастинок, висушених розпиленням та ліофілізованих з манітом, збільшився до 872 та 921 нм відповідно (табл. 2).
Морфологія різних дегідратованих наночастинок інсуліну, що зберігалися протягом трьох місяців: (a) SEM-зображення ліофілізованих наночастинок інсуліну з манітолом; (b) SEM-зображення висушених розпиленням наночастинок інсуліну без манітолу; (c) без манітолу SEM-зображення висушених розпиленням наночастинок інсуліну.
Крім того, у відновлених наночастинках інсуліну, висушених розпиленням з манітолом та ліофілізованих (рис. S2), спостерігалися осади. Це може бути спричинено тим, що великі частинки не суспендуються належним чином у воді. Усі вищезазначені результати демонструють, що метод розпилювального сушіння може захистити наночастинки інсуліну від зневоднення, і що високі завантаження наночастинок інсуліну можна отримати без будь-яких наповнювачів або кріопротекторів.
Затримку інсуліну тестували в середовищі з pH = 2,5 з пепсином, трипсином та α-хімотрипсином, щоб продемонструвати захисну здатність наночастинок (НЧ) до ферментативного розщеплення після дегідратації. Затримку інсуліну зневодненими НЧ порівнювали зі свіжоприготованими НЧ, а вільний інсулін використовували як негативний контроль. У цьому дослідженні вільний інсулін продемонстрував швидку елімінацію інсуліну протягом 4 годин у всіх трьох ферментативних обробках (рис. 5a–c). На противагу цьому, тестування на елімінацію інсуліну ліофілізованих НЧ з манітолом та сушених розпиленням з манітолом або без нього показало значно вищий захист цих НЧ від ферментативного розщеплення, що було подібним до захисту свіжоприготованих НЧ інсуліну (рис. 1).5a-c). За допомогою наночастинок у пепсині, трипсині та α-хімотрипсині, понад 50%, 60% та 75% інсуліну могло бути захищено протягом 4 годин відповідно (рис. 5a–c). Ця інсулінозахисна здатність може збільшити ймовірність вищого всмоктування інсуліну в кровотік25. Ці результати свідчать про те, що спрей... Сушіння з манітолом або без нього, а також ліофілізація з манітолом можуть зберегти інсулінозахисну здатність наночастинок після зневоднення.
Захисна поведінка та поведінка вивільнення дегідратованих наночастинок інсуліну: (a) захист інсуліну в розчині пепсину; (b) захист інсуліну в розчині трипсину; (c) захист інсуліну розчином α-хімотрипсину; (d) Поведінка вивільнення дегідратованих наночастинок у розчині з pH = 2,5; (e) поведінка вивільнення дегідратованих наночастинок у розчині з pH = 6,6; (f) поведінка вивільнення дегідратованих наночастинок у розчині з pH = 7,0.
Свіжоприготовані та відновлені сухі наночастинки інсуліну інкубували в різних буферах (pH = 2,5, 6,6, 7,0) при 37 °C, імітуючи pH-середовище шлунка, дванадцятипалої кишки та верхньої частини тонкої кишки, для дослідження впливу інсуліну на інсулінорезистентність. Поведінка вивільнення в різних середовищах. Фрагмент шлунково-кишкового тракту. При pH = 2,5 інсулін-завантажені наночастинки та розчинені сухі наночастинки інсуліну демонстрували початкове вивільнення протягом першої години, а потім повільне вивільнення протягом наступних 5 годин (рис. 5d). Це швидке вивільнення на початку, найімовірніше, є результатом швидкої поверхневої десорбції молекул білка, які не повністю іммобілізовані у внутрішній структурі частинки. При pH = 6,5 інсулін-завантажені наночастинки та відновлені сухі наночастинки інсуліну демонстрували плавне та повільне вивільнення протягом 6 годин, оскільки pH тестового розчину був подібним до розчину, приготованого з наночастинками (рис. 5e). При pH = 7 наночастинки були нестабільними та майже повністю розкладалися протягом перших двох годин (рис. 5f). Це пояснюється тим, що депротонування хітозану відбувається при вищому pH, що призводить до менш компактної полімерної мережі та вивільнення завантаженого інсуліну.
Крім того, наночастинки інсуліну, висушені розпиленням без манітолу, показали швидший профіль вивільнення, ніж інші зневоднені наночастинки (рис. 5d–f). Як було описано раніше, відновлені наночастинки інсуліну, висушені без манітолу, показали найменший розмір частинок. Дрібні частинки забезпечують більшу площу поверхні, тому більша частина відповідного препарату буде знаходитися на поверхні частинок або поблизу неї, що призведе до швидкого вивільнення препарату26.
Цитотоксичність наночастинок досліджували за допомогою МТТ-аналізу. Як показано на рисунку S4, усі зневоднені наночастинки не мали суттєвого впливу на життєздатність клітин у концентраціях 50–500 мкг/мл, що свідчить про те, що всі зневоднені наночастинки можна безпечно використовувати для досягнення терапевтичного вікна.
Печінка є основним органом, через який інсулін здійснює свої фізіологічні функції. Клітини HepG2 – це лінія клітин гепатоми людини, яка зазвичай використовується як модель поглинання гепатоцитами in vitro. Тут клітини HepG2 використовувалися для оцінки клітинного поглинання наночастинок, зневоднених методами ліофілізації та розпилювального сушіння. Клітинне поглинання за допомогою конфокального лазерного сканування з використанням проточної цитометрії та зору після кількох годин інкубації з вільним інсуліном FITC у концентрації 25 мкг/мл, свіжоприготованими наночастинками, завантаженими інсуліном FITC, та зневодненими наночастинками, завантаженими інсуліном FITC, при рівних концентраціях інсуліну. Були проведені спостереження кількісною мікроскопією (CLSM). Ліофілізовані наночастинки без манітолу руйнувалися під час дегідратації та не оцінювалися в цьому тесті. Інтенсивність внутрішньоклітинної флуоресценції свіжоприготованих наночастинок, завантажених інсуліном, ліофілізованих наночастинок з манітолом та розпилювально-сушених наночастинок з манітолом та без нього (рис. 6a) була в 4,3, 2,6, 2,4 та 4,1 раза вищою, ніж у вільних. Група FITC-інсулін відповідно. (Рис. 6b). Ці результати свідчать про те, що інкапсульований інсулін ефективніше поглинається клітинами, ніж вільний інсулін, головним чином через менший розмір наночастинок, завантажених інсуліном, які утворювалися в дослідженні.
Поглинання клітинами HepG2 після 4 годин інкубації зі свіжоприготованими наночастинками та зневодненими наночастинками: (a) Розподіл поглинання FITC-інсуліну клітинами HepG2. (b) Середнє геометричне значення інтенсивності флуоресценції, проаналізоване за допомогою проточної цитометрії (n = 3), *P < 0,05 порівняно з вільним інсуліном.
Аналогічно, зображення CLSM показали, що інтенсивність флуоресценції FITC свіжоприготованих наночастинок, завантажених FITC-інсуліном, та наночастинок, висушених розпиленням, завантажених FITC-інсуліном (без маніту), була набагато сильнішою, ніж у інших зразків (рис. 6a). Крім того, з додаванням маніту вища в'язкість розчину підвищувала стійкість до клітинного поглинання, що призводило до зниження проліферації інсуліну. Ці результати свідчать про те, що наночастинки, висушені розпиленням без маніту, демонстрували найвищу ефективність клітинного поглинання, оскільки розмір їхніх частинок був меншим, ніж у ліофілізованих наночастинок після повторного розчинення.
Хітозан (середня молекулярна маса 100 кДа, 75–85% деацетильований) був придбаний у Sigma-Aldrich (Оквілл, Онтаріо, Канада). Триполіфосфат натрію (TPP) був придбаний у VWR (Раднор, Пенсільванія, США). Рекомбінантний людський інсулін, використаний у цьому дослідженні, був отриманий від Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Мічений флуоресцеїн ізотіоціанатом (FITC) людський інсулін та 4',6-діамідино-2-феніліндол дигідрохлорид (DAPI) були придбані у Sigma-Aldrich (Оквілл, Онтаріо, Канада). Лінію клітин HepG2 було отримано від ATCC (Манассас, Вірджинія, США). Всі інші реагенти були аналітичного або хроматографічного класу.
Приготуйте розчин CS з концентрацією 1 мг/мл, розчинивши його у подвійно дистильованій воді (DD вода), що містить 0,1% оцтової кислоти. Приготуйте розчини TPP та інсуліну з концентрацією 1 мг/мл, розчинивши їх у DD воді та 0,1% оцтовій кислоті відповідно. Попередню емульсію готували за допомогою високошвидкісного гомогенізатора Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, США). Процес приготування такий: спочатку 2 мл розчину TPP додають до 4 мл розчину інсуліну, суміш перемішують протягом 30 хвилин і повністю перемішують. Потім змішаний розчин додають краплями до розчину CS за допомогою шприца при високошвидкісному перемішуванні (10 000 об/хв). Суміші витримують при високошвидкісному перемішуванні (15 000 об/хв) на льодовій бані протягом 30 хвилин, після чого їх pH доводять до певного рівня для отримання зшитих наночастинок інсуліну. Для подальшої гомогенізації та зменшення розміру частинок наночастинок інсуліну їх обробляють ультразвуком ще 30 хвилин. крижана ванна з використанням ультразвукового обробника зондового типу (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Тельтов, Німеччина).
Наночастинки інсуліну (НПС) були протестовані на Z-середній діаметр, індекс полідисперсності (PDI) та дзета-потенціал за допомогою вимірювань динамічного розсіювання світла (DLS) з використанням Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Австрія) шляхом розведення їх у воді DD при 25°C. Морфологію та розподіл розмірів були охарактеризовані за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа (ТЕМ) Hitachi H7600 (Hitachi, Токіо, Японія), а зображення згодом були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення для обробки зображень Hitachi (Hitachi, Токіо, Японія). Для оцінки ефективності інкапсуляції (EE) та завантажувальної здатності (LC) НП інсуліну, НП піпеткою перенесли в ультрафільтраційні пробірки з граничним значенням молекулярної маси 100 кДа та центрифугували при 500 x g протягом 30 хвилин. Неінкапсульований інсулін у фільтраті кількісно визначили за допомогою системи ВЕРХ Agilent 1100 Series (Agilent, Санта-Клара, Каліфорнія, США), що складається з четвертинного насоса, автосамплера, нагрівача колонки та детектора DAD. Інсулін був проаналізований. за допомогою колонки C18 (Zorbax, 3,5 мкм, 4,6 мм × 150 мм, Agilent, США) та детектування при 214 нм. Рухома фаза являла собою ацетонітрил та воду, що містили 0,1% TFA, градієнтні співвідношення від 10/90 до 100/0, та тривала 10 хвилин. Рухома фаза прокачувалася зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв. Температуру колонки було встановлено на 20 °C. Розрахуйте відсотки EE та LC, використовуючи рівняння (1) та рівняння (2).
Для оптимізації наночастинок інсуліну було протестовано різні співвідношення CS/інсулін від 2,0 до 4,0. Під час приготування додавали різні кількості розчину CS, при цьому суміш інсуліну/TPP підтримували постійною. Наночастинки інсуліну готували в діапазоні pH від 4,0 до 6,5, ретельно контролюючи pH суміші після додавання всіх розчинів (інсуліну, TPP та CS). Енергетична цінність (EE) та розмір частинок наночастинок інсуліну оцінювали при різних значеннях pH та масових співвідношеннях CS/інсулін для оптимізації утворення наночастинок інсуліну.
Оптимізовані наночастинки інсуліну розмістили на алюмінієвому контейнері та накрили тканиною, затягнуту стрічкою. Згодом контейнери з загвинчуванням помістили в сублімаційну сушарку Labconco FreeZone (Labconco, Канзас-Сіті, Міссурі, США), оснащену лотковою сушаркою. Температура та вакуумний тиск були встановлені на рівні -10 °C, 0,350 Торр протягом перших 2 годин, та 0 °C та 0,120 Торр протягом решти 22 годин з 24 годин для отримання сухих наночастинок інсуліну.
Для отримання інкапсульованого інсуліну використовували міні-сушарку розпилення Buchi B-290 (BÜCHI, Флавіль, Швейцарія). Вибрані параметри сушіння були: температура 100 °C, витрата сировини 3 л/хв та витрата газу 4 л/хв.
Наночастинки інсуліну до та після дегідратації були охарактеризовані за допомогою ІЧ-Фур'є-АТР-спектроскопії. Дегідратовані наночастинки, а також вільний інсулін та хітозан були проаналізовані за допомогою ІЧ-Фур'є-спектрофотометра Spectrum 100 (PerkinElmer, Волтем, Массачусетс, США), оснащеного універсальним аксесуаром для відбору проб АТР (PerkinElmer, Волтем, Массачусетс, США). Усереднення сигналів були отримані з 16 сканувань з роздільною здатністю 4 см2 у діапазоні частот 4000-600 см2.
Морфологію сухих наночастинок інсуліну оцінювали за допомогою SEM-зображень ліофілізованих та розпилювально-сушених наночастинок інсуліну, отриманих за допомогою скануючого електронного мікроскопа з фокусованим іонним променем Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Гіллсборо, Орегон, США). Основними використовуваними параметрами були напруга 5 кеВ та струм 30 мА.
Всі зневоднені наночастинки інсуліну були повторно розчинені в дегідратованій воді. Розмір частинок, PDI, EE та LC були знову протестовані за допомогою того ж методу, що згадувався раніше, для оцінки їхньої якості після зневоднення. Стабільність наночастинок ангідроінсуліну також вимірювалася шляхом тестування властивостей наночастинок після тривалого зберігання. У цьому дослідженні всі наночастинки після зневоднення зберігалися в холодильнику протягом трьох місяців. Після трьох місяців зберігання наночастинки були протестовані на морфологічний розмір частинок, PDI, EE та LC.
Розчиніть 5 мл відновлених наночастинок у 45 мл, що містить імітовану шлункову рідину (pH 1,2, що містить 1% пепсину), кишкову рідину (pH 6,8, що містить 1% трипсину) або розчин хімотрипсину (100 г/мл, у фосфатному буфері, pH 7,8), щоб оцінити ефективність інсуліну в захисті наночастинок після дегідратації. Їх інкубували при 37°C зі швидкістю перемішування 100 об/хв. 500 мкл розчину збирали в різні моменти часу, а концентрацію інсуліну визначали за допомогою ВЕРХ.
Поведінку вивільнення in vitro свіжоприготованих та дегідратованих наночастинок інсуліну досліджували методом діалізного мішка (граничне значення молекулярної маси 100 кДа, Spectra Por Inc.). Свіжоприготовані та відновлені сухі наночастинки діалізували в рідинах з pH 2,5, pH 6,6 та pH 7,0 (0,1 М фосфатно-буферний фізіологічний розчин, PBS) для імітації pH-середовища шлунка, дванадцятипалої кишки та верхньої частини тонкої кишки відповідно. Всі зразки інкубували при 37 °C з постійним струшуванням зі швидкістю 200 об/хв. Аспіруйте рідину з-за меж 5-мл діалізного мішка через такі проміжки часу: 0,5, 1, 2, 3, 4 та 6 годин, та негайно поповнюйте об'єм свіжим діалізатом. Забруднення рідини інсуліном аналізували за допомогою ВЕРХ, а швидкість вивільнення інсуліну з наночастинок розраховували за співвідношенням вільного інсуліну, що вивільняється, до загального інсуліну, інкапсульованого в наночастинках (рівняння 3).
Клітини лінії клітин гепатоцелюлярної карциноми людини HepG2 вирощували в чашках діаметром 60 мм з використанням модифікованого середовища Дульбекко (DMEM), що містило 10% фетальної бичачої сироватки, 100 МО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину29. Культури підтримували при температурі 37°C, відносній вологості 95% та 5% CO2. Для аналізу поглинання клітини HepG2 висівали в концентрації 1 × 105 клітин/мл на 8-лункову систему слайдів Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, Нью-Йорк, США). Для аналізу цитотоксичності їх висівали в 96-лункові планшети (Corning, Нью-Йорк, США) при щільності 5 × 104 клітин/мл.
МТТ-аналіз було використано для оцінки цитотоксичності свіжоприготованих та зневоднених наночастинок інсуліну30. Клітини HepG2 висівали в 96-лункові планшети з щільністю 5 × 10⁴ клітин/мл та культивували протягом 7 днів перед тестуванням. Наночастинки інсуліну розводили до різних концентрацій (від 50 до 500 мкг/мл) у культуральному середовищі, а потім вводили до клітин. Після 24 годин інкубації клітини 3 рази промивали PBS та інкубували з середовищем, що містило 0,5 мг/мл МТТ, протягом додаткових 4 годин. Цитотоксичність оцінювали шляхом вимірювання ферментативного відновлення жовтого тетразолієвого МТТ до пурпурового формазану при 570 нм за допомогою спектрофотометричного планшетного рідера Tecan infinite M200 pro (Tecan, Меннедорф, Швейцарія).
Ефективність поглинання наночастинок клітинами перевіряли за допомогою конфокальної лазерної скануючої мікроскопії та проточної цитометрії. Кожну лунку системи слайдів Nunc Lab-Tek камери обробляли вільним FITC-інсуліном, наночастинками, завантаженими FITC-інсуліном, та відновленими 25 мкг/мл дегідратованих наночастинок FITC-інсуліну в тій самій концентрації та інкубували протягом 4 годин. Клітини промивали 3 рази PBS та фіксували 4% параформальдегідом. Ядра фарбували 4',6-діамідино-2-феніліндолом (DAPI). Локалізацію інсуліну спостерігали за допомогою лазерного скануючого/двофотонного конфокального мікроскопа Olympus FV1000 (Olympus, місто Шіндзюку, Токіо, Японія). Для проточної цитометрії однакові концентрації 10 мкг/мл вільного FITC-інсуліну, наночастинок, завантажених FITC-інсуліном, та ресолюбілізованих дегідратованих наночастинок FITC-інсуліну додавали до 96-лункових планшетів, засіяних клітинами HepG2, та інкубували протягом 4 годин. Після 4 годин інкубації клітини видаляли та промивали 3 рази FBS. 5 × 10⁴ клітин на зразок аналізували за допомогою проточного цитометра BD LSR II (BD, Франклін-Лейкс, Нью-Джерсі, США).
Усі значення виражені як середнє значення ± стандартне відхилення. Порівняння між усіма групами оцінювали за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) або t-тесту за допомогою IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Нью-Йорк, США), а значення p < 0,05 вважалося статистично значущим.
Це дослідження демонструє гнучкість та здатність розпилювального сушіння дегідратувати зшиті наночастинки хітозан/TPP/інсулін з кращою відновлюваністю порівняно зі стандартними методами ліофілізації з використанням наповнювачів або кріопротекторів та вищою вантажопідйомністю. Оптимізовані наночастинки інсуліну дали середній розмір частинок 318 нм та ефективність інкапсуляції 99,4%. Результати SEM та FTIR після дегідратації показали, що сферична структура зберігалася лише в розпилювально-сушених наночастинках з манітолом та без нього, а також ліофілізованих з манітолом, але ліофілізовані наночастинки без манітолу розкладалися під час дегідратації. У тесті на здатність до реконституції наночастинки інсуліну, висушені розпиленням без манітолу, показали найменший середній розмір частинок та найбільше навантаження при реконституції. Поведінка вивільнення всіх цих зневоднених наночастинок показала, що вони швидко вивільнялися в розчинах з pH = 2,5 та pH = 7, і дуже стабільні в розчині з pH = 6,5. Порівняно з іншими повторно розчиненими зневодненими наночастинками, наночастинки, висушені розпиленням без манітолу, показали найшвидше. вивільнення. Цей результат узгоджується з результатом, що спостерігався в аналізі клітинного поглинання, оскільки висушені розпиленням наночастинки за відсутності манітолу майже повністю зберегли ефективність клітинного поглинання свіжоприготованих наночастинок. Ці результати свідчать про те, що сухі наночастинки інсуліну, отримані методом розпилювального сушіння без манітолу, найбільш придатні для подальшої переробки в інші безводні лікарські форми, такі як таблетки для перорального застосування або біоадгезивні плівки.
Через проблеми інтелектуальної власності набори даних, згенеровані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, не є загальнодоступними, але можуть бути отримані від відповідних авторів за обґрунтованим запитом.
Каган, А. Цукровий діабет 2 типу: соціальне та наукове походження, медичні ускладнення та наслідки для пацієнтів та інших. (McFarlane, 2009).
Сінгх, А.П., Го, Ю., Сінгх, А., Се, В. та Цзян, П. Розробка інкапсуляції інсуліну: чи можливе пероральне введення зараз? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR. Нещодавні досягнення в пероральних системах доставки інсуліну з ліпосомами для лікування діабету. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).