Стаття є частиною дослідницької теми «Підвищення стійкості бобових культур до патогенів та шкідників», переглянути всі 5 статей
Збудник грибкової хвороби рослин некрозу Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary використовує багаторівневу стратегію для інфікування різних рослин-господарів. У цьому дослідженні пропонується використання діаміну L-орнітину, небілкової амінокислоти, яка стимулює синтез інших незамінних амінокислот, як альтернативної стратегії управління для посилення молекулярних, фізіологічних та біохімічних реакцій Phaseolus vulgaris L. на білу плісняву, спричинену Pseudomonas sclerotiorum. Експерименти in vitro показали, що L-орнітин значно пригнічує ріст міцелію S. pyrenoidosa дозозалежним чином. Більше того, він може значно зменшити тяжкість ураження білою пліснявою в тепличних умовах. Крім того, L-орнітин стимулював ріст оброблених рослин, що свідчить про те, що протестовані концентрації L-орнітину не були фітотоксичними для оброблених рослин. Крім того, L-орнітин посилював експресію неферментативних антиоксидантів (загальні розчинні фенольні сполуки та флавоноїди) та ферментативних антиоксидантів (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) та поліфенолоксидаза (PPO)), а також збільшував експресію трьох генів, пов'язаних з антиоксидантами (PvCAT1, PvSOD та PvGR). Крім того, аналіз in silico виявив наявність передбачуваного білка оксалоацетат ацетилгідролази (SsOAH) у геномі S. sclerotiorum, який був дуже схожий на білки оксалоацетат ацетилгідролази (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) та Penicillium sp. (PlOAH) з точки зору функціонального аналізу, консервативних доменів та топології. Цікаво, що додавання L-орнітину до середовища картопляного декстрозного бульйону (PDB) значно знижувало експресію гена SsOAH у міцелії S. sclerotiorum. Аналогічно, екзогенне застосування L-орнітину значно знизило експресію гена SsOAH у грибковому міцелії, зібраному з оброблених рослин. Нарешті, застосування L-орнітину значно знизило секрецію щавлевої кислоти як у середовищі PDB, так і в інфікованому листі. Таким чином, L-орнітин відіграє ключову роль у підтримці окисно-відновного статусу, а також у посиленні захисної реакції інфікованих рослин. Результати цього дослідження можуть допомогти у розробці інноваційних, екологічно чистих методів боротьби з білою пліснявою та пом'якшення її впливу на виробництво бобових та інших сільськогосподарських культур.
Біла пліснява, спричинена некротрофним грибком Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, є руйнівною хворобою, що знижує врожайність і становить серйозну загрозу для світового виробництва квасолі (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum є одним із найскладніших для боротьби з ґрунтовими грибковими патогенами рослин, з широким спектром хазяїв, що налічує понад 600 видів рослин, та здатністю швидко розмочувати тканини хазяїна неспецифічним чином (Liang and Rollins, 2018). За несприятливих умов вона проходить критичну фазу свого життєвого циклу, залишаючись у стані спокою протягом тривалого часу у вигляді чорних, твердих, насіннєподібних структур, які називаються «склероціями» у ґрунті, або у вигляді білих, пухнастих наростів у міцелії або серцевині стебла заражених рослин (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum здатний утворювати склероції, що дозволяє йому виживати на заражених полях протягом тривалого часу та зберігатися під час хвороби (Schwartz et al., 2005). Склероції багаті на поживні речовини, можуть зберігатися в ґрунті протягом тривалого часу та слугувати первинним інокулятом для подальших інфекцій (Schwartz et al., 2005). За сприятливих умов склероції проростають та утворюють спори, що переносяться повітрям, які можуть інфікувати всі надземні частини рослини, включаючи, але не обмежуючись, квіти, стебла або стручки (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum використовує багаторівневу стратегію для зараження рослин-господарів, що включає серію скоординованих подій від проростання склероцій до розвитку симптомів. Спочатку S. sclerotiorum виробляє зважені спори (так звані аскоспори) з грибоподібних структур, що називаються апотеціями, які потрапляють у повітря та розвиваються в нерухомі склероції на заражених рослинних рештках (Bolton et al., 2006). Потім гриб виділяє щавлеву кислоту, фактор вірулентності, для контролю pH клітинної стінки рослини, сприяння ферментативній деградації та інвазії тканин (Hegedus and Rimmer, 2005), а також пригнічення окислювального вибуху рослини-господаря. Цей процес підкислення послаблює клітинну стінку рослини, забезпечуючи сприятливе середовище для нормальної та ефективної роботи ферментів, що руйнують клітинну стінку грибів (CWDE), дозволяючи патогену подолати фізичний бар'єр та проникнути в тканини хазяїна (Marciano et al., 1983). Після проникнення S. sclerotiorum виділяє низку ферментів розпізнавання образів (CWDE), таких як полігалактуроназа та целюлаза, які сприяють його поширенню в інфікованих тканинах та викликають некроз тканин. Прогресування уражень та гіфальних килимків призводить до характерних симптомів білої цвілі (Hegedus and Rimmer, 2005). Тим часом рослини-господарі розпізнають патоген-асоційовані молекулярні патерни (PAMP) через рецептори розпізнавання образів (PRR), запускаючи серію сигнальних подій, які зрештою активують захисні реакції.
Незважаючи на десятиліття зусиль щодо боротьби з хворобами, у квасолі, як і в інших комерційних культурах, залишається дефіцит достатньої стійкої зародкової плазми через стійкість, виживання та адаптивність патогена. Тому боротьба з хворобами є надзвичайно складною та вимагає комплексної, багатогранної стратегії, що включає поєднання агротехнічних практик, біологічного контролю та хімічних фунгіцидів (O'Sullivan et al., 2021). Хімічний контроль білої плісняви ​​є найефективнішим, оскільки фунгіциди, за умови правильного та своєчасного застосування, можуть ефективно контролювати поширення хвороби, зменшувати тяжкість інфекції та мінімізувати втрати врожаю. Однак надмірне використання та надмірна залежність від фунгіцидів може призвести до появи стійких штамів S. sclerotiorum та негативно вплинути на нецільові організми, здоров'я ґрунту та якість води (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Тому пошук екологічно чистих альтернатив став головним пріоритетом.
Поліаміни (ПА), такі як путресцин, спермідин, спермін та кадаверин, можуть слугувати перспективними альтернативами проти ґрунтових патогенів рослин, тим самим повністю або частково зменшуючи використання небезпечних хімічних фунгіцидів (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). У вищих рослин ПА беруть участь у багатьох фізіологічних процесах, включаючи, але не обмежуючись, поділ клітин, диференціацію та реакцію на абіотичні та біотичні стреси (Killiny and Nehela, 2020). Вони можуть діяти як антиоксиданти, допомагати поглинати активні форми кисню (АФК), підтримувати окисно-відновний гомеостаз (Nehela and Killiny, 2023), індукувати гени, пов'язані із захистом (Romero et al., 2018), регулювати різні метаболічні шляхи (Nehela and Killiny, 2023), модулювати ендогенні фітогормони (Nehela and Killiny, 2019), встановлювати системну набуту стійкість (SAR) та регулювати взаємодію рослин-патогенів (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Варто зазначити, що конкретні механізми та ролі ПА в захисті рослин різняться залежно від виду рослин, патогенів та умов навколишнього середовища. Найбільш поширена ПА в рослинах біосинтезується з незамінного поліаміну L-орнітину (Killiny and Nehela, 2020).
L-орнітин відіграє численні ролі в рості та розвитку рослин. Наприклад, попередні дослідження показали, що у рису (Oryza sativa) орнітин може бути пов'язаний з рециркуляцією азоту (Liu et al., 2018), врожайністю, якістю та ароматом рису (Lu et al., 2020), а також реакцією на водний стрес (Yang et al., 2000). Крім того, екзогенне застосування L-орнітину значно підвищило посухостійкість цукрового буряка (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) та полегшило сольовий стрес у рослин цибулі (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu та Çavuşoǧlu, 2021) та кешью (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Потенційна роль L-орнітину в захисті від абіотичного стресу може бути зумовлена ​​його участю в накопиченні проліну в оброблених рослинах. Наприклад, раніше повідомлялося, що гени, пов'язані з метаболізмом проліну, такі як гени орнітин-дельта-амінотрансферази (дельта-OAT) та проліндегідрогенази (ProDH1 та ProDH2), беруть участь у захисті Nicotiana benthamiana та Arabidopsis thaliana від штамів Pseudomonas syringae, що не є хазяїном (Senthil-Kumar and Mysore, 2012). З іншого боку, грибкова орнітиндекарбоксилаза (ODC) необхідна для росту патогенів (Singh et al., 2020). Вплив на ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici за допомогою індукованого хазяїном генного заглушення (HIGS) значно підвищив стійкість рослин томатів до фузаріозного в'янення (Singh et al., 2020). Однак потенційна роль екзогенного застосування орнітину проти біотичних стресів, таких як фітопатогени, не була добре вивчена. Що ще важливіше, вплив орнітину на стійкість до хвороб та пов'язані з цим біохімічні та фізіологічні явища залишаються значною мірою невивченими.
Розуміння складності інфекції бобових культур, спричиненої S. sclerotiorum, є важливим для розробки ефективних стратегій боротьби. У цьому дослідженні ми мали на меті визначити потенційну роль діаміну L-орнітину як ключового фактора у посиленні захисних механізмів та стійкості бобових рослин до інфекції Sclerotinia sclerotiorum. Ми висуваємо гіпотезу, що, окрім посилення захисних реакцій інфікованих рослин, L-орнітин також відіграє ключову роль у підтримці окисно-відновного статусу. Ми припускаємо, що потенційні ефекти L-орнітину пов'язані з регуляцією ферментативних та неферментативних антиоксидантних захисних механізмів та втручанням у фактори патогенності/вірулентності грибів та пов'язані з ними білки. Ця подвійна функціональність L-орнітину робить його перспективним кандидатом для сталої стратегії пом'якшення впливу білої плісняви ​​та підвищення стійкості звичайних бобових культур до цього потужного грибкового патогену. Результати цього дослідження можуть допомогти у розробці інноваційних, екологічно чистих методів боротьби з білою пліснявою та пом'якшення її впливу на виробництво бобових.
У цьому дослідженні як експериментальний матеріал було використано сприйнятливий комерційний сорт квасолі звичайної Гіза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Здорове насіння люб'язно надано Відділом дослідження бобових культур, Науково-дослідним інститутом польових культур (FCRI), Сільськогосподарським дослідницьким центром (ARC), Єгипет. П'ять насінин висіяли в пластикові горщики (внутрішній діаметр 35 см, глибина 50 см), заповнені ґрунтом, інфікованим S. sclerotiorum, в тепличних умовах (25 ± 2 °C, відносна вологість 75 ± 1%, 8 год світла/16 год темряви). Через 7–10 днів після посіву (DPS) сходи проріджували, щоб залишити лише два сходи з рівномірним ростом і трьома повністю розкритими листками в кожному горщику. Усі рослини в горщиках поливали один раз на два тижні та удобрювали щомісяця за рекомендованою для даного сорту нормою.
Для приготування L-орнітиндіаміну (також відомого як (+)-(S)-2,5-діамінопентанова кислота; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина) концентрацією 500 мг/л спочатку розчинили 50 мг у 100 мл стерильної дистильованої води. Потім маточний розчин розвели та використали в наступних експериментах. Коротко кажучи, шість серій концентрацій L-орнітину (12,5, 25, 50, 75, 100 та 125 мг/л) було протестовано in vitro. Крім того, стерильну дистильовану воду використовували як негативний контроль (мокет), а комерційний фунгіцид «Rizolex-T» 50% змочуваний порошок (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Кафр-ель-Заят, губернаторство Гарбія, Єгипет) використовували як позитивний контроль. Комерційний фунгіцид «Ризолекс-Т» було випробувано in vitro у п'яти концентраціях (2, 4, 6, 8 та 10 мг/л).
Зразки стебел та стручків звичайної квасолі з типовими симптомами білої плісняви ​​(рівень зараження: 10–30%) були зібрані з комерційних ферм. Хоча більшість заражених рослинних матеріалів були ідентифіковані за видами/сортами (чутливий комерційний сорт Giza 3), інші, особливо ті, що були отримані з місцевих ринків, були невідомого виду. Зібрані заражені матеріали спочатку поверхнево дезінфікували 0,5% розчином гіпохлориту натрію протягом 3 хвилин, потім кілька разів промивали стерильною дистильованою водою та витирали насухо стерильним фільтрувальним папером для видалення зайвої води. Потім заражені органи розрізали на дрібні шматочки із середньої тканини (між здоровими та зараженими тканинами), культивували на середовищі з картопляно-декстрозним агаром (PDA) та інкубували при температурі 25 ± 2 °C з циклом 12 годин світло/12 годин темрява протягом 5 днів для стимуляції утворення склероцій. Метод міцеліального кінчика також використовували для очищення грибкових ізолятів зі змішаних або заражених культур. Очищений грибковий ізолят спочатку ідентифікували на основі його культуральних морфологічних характеристик, а потім підтвердили, що він є S. sclerotiorum на основі мікроскопічних ознак. Зрештою, всі очищені ізоляти були перевірені на патогенність на сприйнятливому сорті квасолі звичайної Giza 3 для відповідності постулатам Коха.
Крім того, найбільш інвазивний ізолят S. sclerotiorum (ізолят №3) був додатково підтверджений на основі секвенування внутрішнього транскрибованого спейсера (ITS), як описано White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Коротко кажучи, ізоляти культивували в картопляному декстрозному бульйоні (PDB) та інкубували при температурі 25 ± 2 °C протягом 5–7 днів. Потім грибковий міцелій збирали, фільтрували через марлю, двічі промивали стерильною водою та сушили стерильним фільтрувальним папером. Геномну ДНК виділяли за допомогою набору Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Потім область ITS рДНК ампліфікували за допомогою специфічної пари праймерів ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; очікуваний розмір: 540 п.н.) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Очищені продукти ПЛР надіслали на секвенування (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Послідовності ITS рДНК секвенували двонаправлено за методом секвенування Сангера. Зібрані послідовності запиту потім порівнювали з останніми даними GenBank та Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) за допомогою програмного забезпечення BLASTn. Послідовність запиту порівнювали з 20 іншими штамами/ізолятами S. sclerotiorum, отриманими з останніх даних NCBI GenBank (Додаткова таблиця S1), використовуючи ClustalW у пакеті Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; версія 11) (Kumar et al., 2024). Еволюційний аналіз проводили з використанням методу максимальної правдоподібності та загальної моделі оборотної в часі заміни нуклеотидів (Nei and Kumar, 2000). Показано дерево з найвищою логарифмічною правдоподібністю. Початкове дерево для евристичного пошуку вибирається шляхом вибору дерева з найвищою логарифмічною правдоподібністю між деревом об'єднання сусідів (NJ) (Kumar et al., 2024) та деревом максимальної економії (MP). Дерево NJ було побудовано з використанням попарної матриці відстаней, розрахованої з використанням загальної оборотної в часі моделі (Nei and Kumar, 2000).
Антибактеріальну активність L-орнітину та бактерициду «Ризолекс-Т» визначали in vitro методом агар-дифузії. Метод: Взяли відповідну кількість маточного розчину L-орнітину (500 мг/л) та ретельно перемішали його з 10 мл поживного середовища PDA для приготування розчинів з кінцевими концентраціями 12,5, 25, 50, 75, 100 та 125 мг/л відповідно. П'ять концентрацій фунгіциду «Ризолекс-Т» (2, 4, 6, 8 та 10 мг/л) та стерильну дистильовану воду використовували як контроль. Після затвердіння середовища свіжоприготований міцеліальний штангу культури Sclerotinia sclerotiorum діаметром 4 мм переносили в центр чашки Петрі та культивували при температурі 25±2°C, доки міцелій не покрив всю контрольну чашку Петрі, після чого реєстрували ріст гриба. Розрахуйте відсоток пригнічення радіального росту S. sclerotiorum, використовуючи рівняння 1:
Експеримент повторили двічі, з шістьма біологічними повторностями для кожної контрольної/експериментальної групи та п'ятьма горщиками (дві рослини в горщику) для кожного біологічного повтору. Кожен біологічний повтор аналізували двічі (дві технічні повторності) для забезпечення точності, надійності та відтворюваності експериментальних результатів. Крім того, для розрахунку напівмаксимальної інгібуючої концентрації (IC50) та IC99 було використано пробіт-регресійний аналіз (Prentice, 1976).
Для оцінки потенціалу L-орнітину в тепличних умовах було проведено два послідовні експерименти з горщиками. Коротко кажучи, горщики були заповнені стерилізованим глинисто-піщаним ґрунтом (3:1) та інокульовані свіжоприготовленою культурою S. sclerotiorum. Спочатку найбільш інвазивний ізолят S. sclerotiorum (ізолят №3) культивували, розрізавши один склероцій навпіл, помістивши його лицьовою стороною донизу на PDA та інкубуючи при 25°C у постійній темряві (24 год) протягом 4 днів для стимуляції росту міцелію. Потім чотири агарові пробки діаметром 5 мм брали з переднього краю та інокулювали 100 г стерильної суміші пшеничних та рисових висівок (1:1, об./об.), після чого всі колби інкубували при 25 ± 2°C за циклу 12 годин світло/12 годин темрява протягом 5 днів для стимуляції утворення склероцій. Вміст усіх колб ретельно перемішували для забезпечення однорідності перед додаванням ґрунту. Потім у кожен горщик додали 100 г суміші висівок для колонізації, щоб забезпечити постійну концентрацію патогенів. Інокульовані горщики полили для активації росту грибів і помістили в тепличні умови на 7 днів.
Потім у кожен горщик висіяли по п'ять насінин сорту Giza 3. Для горщиків, оброблених L-орнітином та фунгіцидом Rizolex-T, стерилізоване насіння спочатку замочували протягом двох годин у водному розчині двох сполук з кінцевою концентрацією IC99 близько 250 мг/л та 50 мг/л відповідно, а потім сушили на повітрі протягом однієї години перед посівом. З іншого боку, насіння замочували у стерильній дистильованій воді як негативний контроль. Через 10 днів, перед першим поливом, сходи проріджували, залишаючи лише два акуратні сходи в кожному горщику. Крім того, щоб забезпечити інфікування S. sclerotiorum, стебла рослин квасолі на одній стадії розвитку (10 днів) зрізали у двох різних місцях за допомогою стерилізованого скальпеля, і приблизно 0,5 г колонізуючої суміші висівок поміщали в кожну рану, після чого забезпечували високу вологість для стимулювання інфекції та розвитку хвороби у всіх інокульованих рослин. Контрольні рослини були поранені аналогічним чином, і в рану помістили рівну кількість (0,5 г) стерильної, неколонізованої суміші висівок і підтримували при високій вологості, щоб імітувати середовище для розвитку хвороби та забезпечити узгодженість між групами лікування.
Спосіб обробки: Розсаду квасолі поливали 500 мл водного розчину L-орнітину (250 мг/л) або фунгіциду Rizolex-T (50 мг/л) шляхом зрошення ґрунту, потім обробку повторювали тричі з інтервалом 10 днів. Контрольну групу, що отримувала плацебо, зрошували 500 мл стерильної дистильованої води. Усі обробки проводили в тепличних умовах (25 ± 2°C, відносна вологість 75 ± 1% та фотоперіод 8 год світла/16 год темряви). Усі горщики поливали раз на два тижні та щомісяця обробляли збалансованим добривом NPK (20-20-20, з 3,6% сірки та мікроелементами TE; Zain Seeds, Єгипет) у концентрації 3–4 г/л шляхом позакореневого обприскування відповідно до рекомендацій для конкретного сорту та інструкцій виробника. Якщо не зазначено інше, повністю розрослене зріле листя (2-й та 3-й листки зверху) збирали з кожної біологічної повторності через 72 години після обробки (г.п.), гомогенізували, об'єднували та зберігали при температурі -80 °C для подальшого аналізу, включаючи, але не обмежуючись, гістохімічну локалізацію індикаторів оксидативного стресу in situ, перекисне окислення ліпідів, ферментативні та неферментативні антиоксиданти та експресію генів.
Інтенсивність зараження білою пліснявою оцінювали щотижня через 21 день після інокуляції (dpi) за шкалою від 1 до 9 (Додаткова таблиця S2), що базується на шкалі Петцольдта та Діксона (1996), модифікованій Теран та ін. (2006). Коротко кажучи, стебла та гілки рослин квасолі досліджували, починаючи з місця інокуляції, щоб відстежити прогресування уражень вздовж міжвузлів та вузлів. Потім вимірювали відстань ураження від місця інокуляції до найвіддаленішої точки вздовж стебла або гілки, і залежно від розташування ураження встановлювали бал від 1 до 9, де (1) вказував на відсутність видимої інфекції поблизу місця інокуляції, а (2–9) вказував на поступове збільшення розміру ураження та прогресування вздовж вузлів/міжвузлів (Додаткова таблиця S2). Інтенсивність зараження білою пліснявою потім перетворювали у відсотки за формулою 2:
Крім того, площу під кривою прогресування захворювання (AUDPC) розраховували за формулою (Shaner and Finney, 1977), яка нещодавно була адаптована для білої гнилі звичайної квасолі (Chauhan et al., 2020) з використанням рівняння 3:
Де Yi = тяжкість захворювання на момент часу ti, Yi+1 = тяжкість захворювання на наступний момент часу ti+1, ti = час першого вимірювання (у днях), ti+1 = час наступного вимірювання (у днях), n = загальна кількість точок часу або точок спостереження. Параметри росту рослин квасолі, включаючи висоту рослини (см), кількість гілок на рослину та кількість листків на рослину, реєструвалися щотижня протягом 21 дня у всіх біологічних повторностях.
У кожному біологічному повторі зразки листя (другий та третій повністю розвинені листки зверху) збирали на 45-й день після обробки (через 15 днів після останньої обробки). Кожен біологічний повтор складався з п'яти горщиків (по дві рослини в горщику). Близько 500 мг подрібненої тканини використовували для екстракції фотосинтетичних пігментів (хлорофілу a, хлорофілу b та каротиноїдів) з використанням 80% ацетону при 4 °C у темряві. Через 24 години зразки центрифугували, а супернатант збирали для колориметричного визначення вмісту хлорофілу a, хлорофілу b та каротиноїдів за допомогою спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія) згідно з методом (Lichtenthaler, 1987) шляхом вимірювання поглинання на трьох різних довжинах хвиль (A470, A646 та A663 нм). Нарешті, вміст фотосинтетичних пігментів розраховували за допомогою наступних формул 4–6, описаних Lichtenthaler (1987).
Через 72 години після обробки (hpt) з кожної біологічної репліки збирали листя (другий та третій повністю розвинені листки зверху) для гістохімічної локалізації in situ перекису водню (H2O2) та супероксидного аніона (O2•−). Кожна біологічна репліка складалася з п'яти горщиків (дві рослини в горщику). Кожну біологічну репліку аналізували у двох дублікатах (дві технічні репліки) для забезпечення точності, надійності та відтворюваності методу. H2O2 та O2•− визначали за допомогою 0,1% 3,3′-діамінобензидину (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина) або нітросинього тетразолію (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина) відповідно, дотримуючись методів, описаних Romero-Puertas et al. (2004) та Adam et al. (1989) з незначними модифікаціями. Для гістохімічної локалізації H2O2 in situ листки інфільтрували у вакуумі 0,1% DAB у 10 мМ Tris-буфері (pH 7,8), а потім інкубували при кімнатній температурі на світлі протягом 60 хвилин. Листки знебарвлювали у 0,15% (об./об.) TCA у суміші етанол:хлороформ 4:1 (об./об.) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каїр, Єгипет), а потім піддавали впливу світла до потемніння. Аналогічно, клапани інфільтрували у вакуумі 10 мМ калій-фосфатним буфером (pH 7,8), що містив 0,1 мас./об. % HBT, для гістохімічної локалізації O2•− in situ. Листки інкубували на світлі при кімнатній температурі протягом 20 хвилин, потім знебарвлювали, як зазначено вище, а потім освітлювали до появи темно-синіх/фіолетових плям. Інтенсивність результуючого коричневого (як індикатор H2O2) або синьо-фіолетового (як індикатор O2•−) кольору оцінювали за допомогою версії пакета обробки зображень ImageJ для Фіджі (http://fiji.sc; дата звернення: 7 березня 2024 р.).
Малоновий діальдегід (МДА; як маркер перекисного окислення ліпідів) визначали за методом Ду та Брамладжа (1992) з незначними модифікаціями. Листя з кожної біологічної репліки (другий та третій повністю розвинені листки зверху) збирали через 72 години після обробки (г/г). Кожна біологічна репліка включала п'ять горщиків (дві рослини на горщик). Кожну біологічну репліку аналізували у двох дублікатах (дві технічні репліки), щоб забезпечити точність, надійність та відтворюваність методу. Коротко кажучи, 0,5 г подрібненої тканини листя використовували для екстракції МДА з 20% трихлороцтовою кислотою (TCA; MilliporeSigma, Берлінгтон, Массачусетс, США), що містила 0,01% бутильованого гідрокситолуолу (BHT; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Вміст МДА в супернатанті потім визначали колориметрично, вимірюючи поглинання при 532 та 600 нм за допомогою спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія), а потім виражали у нмоль г−1 FW.
Для оцінки неферментативних та ферментативних антиоксидантів листя (другий та третій повністю розвинені листки зверху) збирали з кожної біологічної повторності через 72 години після обробки (г.п.). Кожна біологічна повторність складалася з п'яти горщиків (дві рослини в горщику). Кожен біологічний зразок аналізували у двох дублікатах (два технічні зразки). Два листки подрібнювали рідким азотом та використовували безпосередньо для визначення ферментативних та неферментативних антиоксидантів, загального вмісту амінокислот, вмісту проліну, експресії генів та кількісного визначення оксалату.
Загальний вміст розчинних фенолів визначали за допомогою реактиву Фоліна-Чокальтеу (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) з незначними модифікаціями методу, описаного Кахконеном та ін. (1999). Коротко кажучи, приблизно 0,1 г гомогенізованої тканини листя екстрагували 20 мл 80% метанолу в темряві протягом 24 годин, а супернатант збирали після центрифугування. 0,1 мл екстракту зразка змішували з 0,5 мл реактиву Фоліна-Чокальтеу (10%), струшували протягом 30 секунд і залишали в темряві на 5 хвилин. Потім до кожної пробірки додавали 0,5 мл 20% розчину карбонату натрію (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каїр, Єгипет), ретельно перемішували та інкубували при кімнатній температурі в темряві протягом 1 години. Після інкубації поглинання реакційної суміші вимірювали при 765 нм за допомогою спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія). Концентрацію загальних розчинних фенолів у зразках екстрактів визначали за допомогою калібрувальної кривої галової кислоти (Fisher Scientific, Гемптон, Нью-Гемпшир, США) та виражали в міліграмах еквівалента галової кислоти на грам сирої маси (мг GAE г-1 сирої маси).
Загальний вміст розчинних флавоноїдів визначали за методом Джерідане та ін. (2006) з незначними модифікаціями. Коротко кажучи, 0,3 мл вищезгаданого метанольного екстракту змішували з 0,3 мл 5% розчину хлориду алюмінію (AlCl3; Fisher Scientific, Гемптон, Нью-Гемпшир, США), енергійно перемішували та інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, після чого додавали 0,3 мл 10% розчину ацетату калію (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каїр, Єгипет), ретельно перемішували та інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин у темряві. Після інкубації поглинання реакційної суміші вимірювали при 430 нм за допомогою спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія). Концентрацію загальних розчинних флавоноїдів у зразках екстрактів визначали за допомогою калібрувальної кривої рутину (TCI America, Портленд, Орегон, США), а потім виражали в міліграмах еквівалента рутину на грам сирої маси (мг RE г-1 сирої маси).
Загальний вміст вільних амінокислот у листі квасолі визначали за допомогою модифікованого нінгідринового реагенту (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, США) на основі методу, запропонованого Йокоямою та Хірамацу (2003) та модифікованого Саном та ін. (2006). Коротко кажучи, 0,1 г подрібненої тканини екстрагували буфером з pH 5,4, а 200 мкл супернатанту обробляли 200 мкл нінгідрину (2%) та 200 мкл піридину (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, США), інкубували на киплячій водяній бані протягом 30 хвилин, потім охолоджували та вимірювали при 580 нм за допомогою спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Японія). З іншого боку, пролін визначали методом Бейтса (Bates et al., 1973). Пролін екстрагували 3% сульфосаліциловою кислотою (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, США) і після центрифугування 0,5 мл супернатанту змішували з 1 мл льодовикової оцтової кислоти (Fisher Scientific, Hampton, NH, США) та нінгідриновим реагентом, інкубували при 90°C протягом 45 хвилин, охолоджували та вимірювали при 520 нм за допомогою того ж спектрофотометра, що й вище. Загальну кількість вільних амінокислот та проліну в екстрактах листя визначали за допомогою калібрувальних кривих гліцину та проліну (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, США) відповідно та виражали в мг/г сирої ваги.
Для визначення ферментативної активності антиоксидантних ферментів приблизно 500 мг гомогенізованої тканини екстрагували 3 мл 50 мМ Tris-буфера (pH 7,8), що містив 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) та 7,5% полівінілпіролідону (PVP; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), центрифугували при 10 000 × g протягом 20 хвилин у холодильнику (4 °C), а супернатант (неочищений екстракт ферменту) збирали (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Каталазу (CAT) потім піддали реакції з 2 мл 0,1 М натрій-фосфатного буфера (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) та 100 мкл 269 мМ розчину H2O2 для визначення її ферментативної активності згідно з методом Aebi (1984) з незначними модифікаціями (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ферментативну активність гваякол-залежної пероксидази (POX) визначали за методом Harrach et al. (2009). (2008) з незначними модифікаціями (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), а ферментативну активність поліфенолоксидази (PPO) визначали після реакції з 2,2 мл 100 мМ натрій-фосфатного буфера (pH 6,0), 100 мкл гваяколу (TCI chemicals, Портленд, Орегон, США) та 100 мкл 12 мМ H2O2. Метод був дещо модифікований порівняно з (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Аналіз проводили після реакції з 3 мл розчину катехолу (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, Массачусетс, США) (0,01 М), свіжоприготованого у 0,1 М фосфатному буфері (pH 6,0). Активність CAT вимірювали шляхом моніторингу розкладання H2O2 при 240 нм (A240), активність POX вимірювали шляхом моніторингу збільшення поглинання при 436 нм (A436), а активність PPO вимірювали шляхом реєстрації коливань поглинання при 495 нм (A495) кожні 30 с протягом 3 хвилин за допомогою спектрофотометра UV-160A (Shimadzu, Японія).
Для виявлення рівнів транскриптів трьох генів, пов'язаних з антиоксидантами, включаючи пероксисомну каталазу (PvCAT1; номер доступу GenBank KF033307.1), супероксиддисмутази (PvSOD; номер доступу GenBank XM_068639556.1) та глутатіонредуктазу (PvGR; номер доступу GenBank KY195009.1), у листках квасолі (другий та третій повністю розвинені листки зверху) через 72 години після останньої обробки було використано ПЛР у реальному часі. Коротко кажучи, РНК виділяли за допомогою набору для екстракції загальної РНК Simply P (кат. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Китай) згідно з протоколом виробника. Потім кДНК синтезували за допомогою набору для синтезу кДНК TOP script™ згідно з інструкціями виробника. Послідовності праймерів вищезазначених трьох генів наведено в Додатковій таблиці S3. PvActin-3 (номер доступу GenBank: XM_068616709.1) було використано як ген господарського призначення, а відносну експресію гена розрахували за допомогою методу 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001). Було продемонстровано стабільність актину за умов біотичного стресу (несумісна взаємодія між звичайними бобовими рослинами та антракнозним грибом Colletotrichum lindemuthianum) та абіотичного стресу (посуха, засоленість, низька температура) (Borges et al., 2012).
Спочатку ми провели повний геномний in silico аналіз білків оксалоацетат ацетилгідролази (OAH) у S. sclerotiorum за допомогою інструменту BLAST protein-protein (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Коротко кажучи, ми використовували OAH з Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; номер доступу GenBank XP_040799428.1; 342 амінокислоти) та Penicillium lagena (PlOAH; таксид: 94218; номер доступу GenBank XP_056833920.1; 316 амінокислот) як послідовності запиту для картування гомологічного білка у S. sclerotiorum (таксид: 5180). BLASTp було проведено на основі останніх доступних даних геному S. sclerotiorum з GenBank на веб-сайті Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Крім того, передбачений ген OAH з S. sclerotiorum (SsOAH), а також еволюційний аналіз і філогенетичне дерево AfOAH з A. fijiensis CBS 313.89 і PlOAH з P. lagena були виведені за допомогою методу максимальної правдоподібності в MEGA11 (Tamura et al., 2021) та матричної моделі JTT (Jones et al., 1992). Філогенетичне дерево було поєднане з аналізом множинного вирівнювання білкових послідовностей усіх передбачених генів OAH (SsOAH) з S. sclerotiorum та послідовності запиту за допомогою інструменту вирівнювання на основі обмежень (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). Крім того, найкраще відповідні амінокислотні послідовності SsOAH з S. sclerotiorum були вирівняні з послідовностями запиту (AfOAH та PlOAH) (Larkin et al., 2007) за допомогою ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), а консервативні області у вирівнюванні були візуалізовані за допомогою інструменту ESPript (версія 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Крім того, передбачені функціональні репрезентативні домени та консервативні сайти S. sclerotiorum SsOAH були інтерактивно класифіковані за різними родинами за допомогою інструменту InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Нарешті, тривимірне (3D) моделювання структури передбаченої S. sclerotiorum SsOAH було виконано за допомогою механізму розпізнавання гомології/аналогії протеїнів (сервер Phyre2 версії 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) та перевірено за допомогою сервера SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Передбачені тривимірні структури (формат PDB) були інтерактивно візуалізовані за допомогою пакета UCSF-Chimera (версія 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Для визначення рівня транскрипції оксалоацетат ацетилгідролази (SsOAH; номер доступу GenBank: XM_001590428.1) у міцелії Sclerotinia sclerotiorum використовували кількісну флуоресцентну ПЛР у реальному часі. Коротко кажучи, S. sclerotiorum інокулювали у колбу, що містить PDB, та поміщали у струшувальний інкубатор (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, США) при температурі 25 ± 2 °C протягом 24 годин при 150 об/хв та у постійній темряві (24 год) для стимуляції росту міцелію. Після цього клітини обробляли L-орнітином та фунгіцидом Rizolex-T у кінцевих концентраціях IC50 (приблизно 40 та 3,2 мг/л відповідно), а потім культивували ще протягом 24 годин за тих самих умов. Після інкубації культури центрифугували при 2500 об/хв протягом 5 хвилин, а супернатант (грибний міцелій) збирали для аналізу експресії генів. Аналогічно, грибний міцелій збирали через 0, 24, 48, 72, 96 та 120 годин після інфікування з інфікованих рослин, які утворили білу плісняву та бавовняний міцелій на поверхні інфікованих тканин. РНК екстрагували з грибного міцелію, а потім синтезували кДНК, як описано вище. Послідовності праймерів для SsOAH наведено в Додатковій таблиці S3. SsActin (номер доступу GenBank: XM_001589919.1) використовували як ген-контролер, а відносну експресію генів розраховували за допомогою методу 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001).
Щавлеву кислоту визначали в картопляному декстрозному бульйоні (PDB) та зразках рослин, що містили грибковий патоген Sclerotinia sclerotiorum, згідно з методом Сюй та Чжана (2000) з незначними модифікаціями. Коротко кажучи, ізоляти S. sclerotiorum інокулювали в колби, що містили PDB, а потім культивували в струшувальному інкубаторі (модель I2400, New Brunswick Scientific Co., Едісон, Нью-Джерсі, США) при 150 об/хв при 25 ± 2 °C протягом 3–5 днів у постійній темряві (24 год) для стимуляції росту міцелію. Після інкубації грибкову культуру спочатку фільтрували через фільтрувальний папір Whatman №1, а потім центрифугували при 2500 об/хв протягом 5 хвилин для видалення залишків міцелію. Супернатант збирали та зберігали при 4 °C для подальшого кількісного визначення оксалату. Для приготування зразків рослин приблизно 0,1 г фрагментів рослинної тканини тричі екстрагували дистильованою водою (по 2 мл кожного разу). Потім зразки центрифугували при 2500 об/хв протягом 5 хвилин, супернатант фільтрували насухо через фільтрувальний папір Whatman № 1 та збирали для подальшого аналізу.
Для кількісного аналізу щавлевої кислоти реакційну суміш готували у скляній пробірці з корком у такому порядку: 0,2 мл зразка (або фільтрату культури PDB, або стандартного розчину щавлевої кислоти), 0,11 мл бромфенолового синього (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Піттсбург, Пенсільванія, США), 0,198 мл 1 М сірчаної кислоти (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каїр, Єгипет) та 0,176 мл 100 мМ дихромату калію (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, Орегон, США), а потім розчин розводили до 4,8 мл дистильованою водою, енергійно перемішували та негайно поміщали у водяну баню з температурою 60 °C. Через 10 хвилин реакцію зупиняли додаванням 0,5 мл розчину гідроксиду натрію (NaOH; 0,75 М). Поглинання (A600) реакційної суміші вимірювали при 600 нм за допомогою спектрофотометра UV-160 (Shimadzu Corporation, Японія). PDB та дистильована вода використовувалися як контролі для кількісного визначення фільтратів культури та зразків рослин відповідно. Концентрації щавлевої кислоти у фільтратах культури, виражені в мікрограмах щавлевої кислоти на мілілітр середовища PDB (мкг·мл−1), та в екстрактах листя, виражені в мікрограмах щавлевої кислоти на грам сирої маси (мкг·г−1 FW), визначали за допомогою калібрувальної кривої щавлевої кислоти (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, США).
Протягом дослідження всі експерименти були розроблені за повністю рандомізованим дизайном (CRD) з шістьма біологічними повторностями на обробку та п'ятьма горщиками на біологічну повторність (дві рослини на горщик), якщо не зазначено інше. Біологічні повторності аналізували у двох дублікатах (дві технічні повторності). Технічні повторності використовували для перевірки відтворюваності того самого експерименту, але не використовували у статистичному аналізі, щоб уникнути помилкових повторень. Дані були статистично проаналізовані за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим тестом на значущу різницю (HSD) за Тьюкі-Крамером (p ≤ 0,05). Для експериментів in vitro значення IC50 та IC99 розраховували за допомогою пробіт-моделі та розраховували 95% довірчі інтервали.
Загалом було зібрано чотири ізоляти з різних соєвих полів у губернаторстві Ель-Габія, Єгипет. На середовищі PDA всі ізоляти утворили кремово-білий міцелій, який швидко ставав ватно-білим (Рисунок 1A), а потім бежевим або коричневим на стадії склероціїв. Склероції зазвичай щільні, чорні, сферичної або неправильної форми, довжиною від 5,2 до 7,7 мм та діаметром від 3,4 до 5,3 мм (Рисунок 1B). Хоча чотири ізоляти розвинули крайовий візерунок склероцій на краю культурального середовища після 10–12 днів інкубації при температурі 25 ± 2 °C (Рис. 1A), кількість склероцій на чашку суттєво відрізнялася між ними (P < 0,001), причому ізолят 3 мав найбільшу кількість склероцій (32,33 ± 1,53 склероціїв на чашку; Рис. 1C). Аналогічно, ізолят №3 продукував більше щавлевої кислоти в PDB, ніж інші ізоляти (3,33 ± 0,49 мкг·мл−1; рис. 1D). Ізолят №3 демонстрував типові морфологічні та мікроскопічні характеристики фітопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum. Наприклад, на PDA колонії ізоляту №3 швидко росли, були кремово-білими (рис. 1A), зворотно-бежевими або світло-лососево-жовто-коричневими, і їм потрібно було 6-7 днів при 25 ± 2°C, щоб повністю покрити поверхню пластини діаметром 9 см. На основі вищезазначених морфологічних та мікроскопічних характеристик ізолят №3 був ідентифікований як Sclerotinia sclerotiorum.
Рисунок 1. Характеристики та патогенність ізолятів S. sclerotiorum із звичайних бобових культур. (A) Ріст міцелію чотирьох ізолятів S. sclerotiorum на середовищі PDA, (B) склероції чотирьох ізолятів S. sclerotiorum, (C) кількість склероцій (на чашку), (D) секреція щавлевої кислоти на середовищі PDB (мкг·мл−1) та (E) тяжкість захворювання (%) чотирьох ізолятів S. sclerotiorum на сприйнятливому комерційному сорті бобових Giza 3 у тепличних умовах. Значення представляють середнє значення ± стандартне відхилення п'яти біологічних повторностей (n = 5). Різні літери вказують на статистично значущі відмінності між варіантами обробки (p < 0,05). (F–H) Типові симптоми білої плісняви ​​з'явилися на надземних стеблах та пагонах відповідно через 10 днів після інокуляції ізолятом №3 (dpi). (I) Еволюційний аналіз області внутрішнього транскрибованого спейсера (ITS) ізоляту S. sclerotiorum №3 було проведено з використанням методу максимальної правдоподібності та порівняно з 20 референтними ізолятами/штамами, отриманими з бази даних Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Числа над лініями кластеризації вказують на охоплення області (%), а числа під лініями кластеризації вказують на довжину гілки.
Крім того, для підтвердження патогенності чотири отримані ізоляти S. sclerotiorum були використані для інокуляції чутливого комерційного сорту квасолі Giza 3 в тепличних умовах, що узгоджується з постулатами Коха (рис. 1E). Хоча всі отримані грибкові ізоляти були патогенними та могли інфікувати зелену квасолю (сорт Giza 3), викликаючи типові симптоми білої плісняви ​​на всіх надземних частинах (рис. 1F), особливо на стеблах (рис. 1G) та стручках (рис. 1H) через 10 днів після інокуляції (dpi), ізолят 3 був найагресивнішим ізолятом у двох незалежних експериментах. Ізолят 3 мав найвищу тяжкість захворювання (%) на рослинах квасолі (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 та 76,7 ± 3,1 через 7, 14 та 21 день після інфікування відповідно; рис. 1F).
Ідентифікацію найбільш інвазивного ізоляту S. sclerotiorum №3 було додатково підтверджено на основі секвенування внутрішнього транскрибованого спейсера (ITS) (рис. 1I). Філогенетичний аналіз між ізолятом №3 та 20 референсними ізолятами/штамами показав високу схожість (>99%) між ними. Варто зазначити, що ізолят S. sclerotiorum №3 (533 п.н.) має високу схожість з американським ізолятом S. sclerotiorum LPM36, виділеним із сухого насіння гороху (номер доступу GenBank MK896659.1; 540 п.н.), та китайським ізолятом S. sclerotiorum YKY211 (номер доступу GenBank OR206374.1; 548 п.н.), який спричиняє стеблову гниль фіалки (Matthiola incana), всі з яких згруповані окремо у верхній частині дендрограми (рис. 1I). Нову послідовність було депоновано в базі даних NCBI та названо «Sclerotinia sclerotiorum – ізолят YN-25» (номер доступу GenBank PV202792). Видно, що ізолят 3 є найбільш інвазивним ізолятом; тому цей ізолят був обраний для дослідження в усіх наступних експериментах.
Антибактеріальну активність діаміну L-орнітину (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина) у різних концентраціях (12,5, 25, 50, 75, 100 та 125 мг/л) проти ізоляту 3 S. sclerotiorum досліджували in vitro. Примітно, що L-орнітин мав антибактеріальний ефект і поступово пригнічував радіальний ріст гіф S. sclerotiorum дозозалежним чином (Рисунок 2A, B). При найвищій протестованій концентрації (125 мг/л) L-орнітин продемонстрував найвищий рівень пригнічення росту міцелію (99,62 ± 0,27%; Рисунок 2B), що було еквівалентно комерційному фунгіциду Rizolex-T (рівень пригнічення 99,45 ± 0,39%; Рисунок 2C) при найвищій протестованій концентрації (10 мг/л), що свідчить про подібну ефективність.
Рисунок 2. Антибактеріальна активність L-орнітину проти Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Порівняння антибактеріальної активності різних концентрацій L-орнітину проти S. sclerotiorum з комерційним фунгіцидом Rizolex-T (10 мг/л). (B, C) Швидкість пригнічення (%) росту міцелію S. sclerotiorum після обробки різними концентраціями L-орнітину (12,5, 25, 50, 75, 100 та 125 мг/л) або Rizolex-T (2, 4, 6, 8 та 10 мг/л) відповідно. Значення представляють середнє значення ± стандартне відхилення п'яти біологічних повторностей (n = 5). Різні літери позначають статистичні відмінності між обробками (p < 0,05). (D, E) Регресійний аналіз моделі Probit L-орнітину та комерційного фунгіциду Rizolex-T відповідно. Лінія регресії пробіт-моделі показана суцільною синьою лінією, а довірчий інтервал (95%) — пунктирною червоною лінією.
Крім того, було проведено пробіт-регресійний аналіз, відповідні графіки якого наведено в Таблиці 1 та Рисунках 2D,E. Коротко кажучи, прийнятне значення нахилу (y = 2,92x − 4,67) та пов'язана з ним значуща статистика (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 та p < 0,0001; Рисунок 2D) L-орнітину вказували на посилену протигрибкову активність проти S. sclerotiorum порівняно з комерційним фунгіцидом Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 та p < 0,0001) (Таблиця 1).
Таблиця 1. Значення напівмаксимальної інгібуючої концентрації (IC50) та IC99 (мг/л) L-орнітину та комерційного фунгіциду «Ризолекс-Т» проти S. sclerotiorum.
Загалом, L-орнітин (250 мг/л) значно зменшив розвиток та тяжкість ураження білою пліснявою на оброблених рослинах звичайної квасолі порівняно з необробленими рослинами, інфікованими S. sclerotiorum (контроль; Рисунок 3А). Коротко кажучи, хоча тяжкість захворювання необроблених інфікованих контрольних рослин поступово зростала (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 та 92,33 ± 3,06%), L-орнітин значно зменшив тяжкість захворювання (%) протягом усього експерименту (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 та 26,36 ± 3,07) через 7, 14 та 21 день після обробки (dpt) відповідно (Рисунок 3А). Аналогічно, коли рослини квасолі, інфіковані S. sclerotiorum, обробляли L-орнітином у концентрації 250 мг/л, площа під кривою прогресування хвороби (AUDPC) зменшилася з 1274,33 ± 33,13 у необробленому контролі до 281,03 ± 7,95, що було дещо нижче, ніж у випадку позитивного контролю з фунгіцидом Rizolex-T у концентрації 50 мг/л (183,61 ± 7,71; рис. 3B). Така ж тенденція спостерігалася і в другому експерименті.
Рис. 3. Вплив екзогенного застосування L-орнітину на розвиток білої гнилі звичайної квасолі, спричиненої Sclerotinia sclerotiorum, в умовах теплиці. (A) Крива прогресування захворювання білої гнилі звичайної квасолі після обробки 250 мг/л L-орнітину. (B) Площа під кривою прогресування захворювання (AUDPC) білої гнилі звичайної квасолі після обробки L-орнітином. Значення представляють середнє значення ± стандартне відхилення п'яти біологічних повторностей (n = 5). Різні літери позначають статистично значущі відмінності між варіантами обробки (p < 0,05).
Екзогенне застосування L-орнітину в дозі 250 мг/л поступово збільшувало висоту рослин (рис. 4A), кількість гілок на рослину (рис. 4B) та кількість листків на рослину (рис. 4C) через 42 дні. У той час як комерційний фунгіцид Rizolex-T (50 мг/л) мав найбільший вплив на всі досліджувані параметри живлення, екзогенне застосування L-орнітину в дозі 250 мг/л мало другий за величиною ефект порівняно з необробленим контролем (рис. 4A–C). З іншого боку, обробка L-орнітином не мала суттєвого впливу на вміст фотосинтетичних пігментів хлорофілу a (рис. 4D) та хлорофілу b (рис. 4E), але дещо збільшила загальний вміст каротиноїдів (0,56 ± 0,03 мг/г сухої маси) порівняно з негативним контролем (0,44 ± 0,02 мг/г сухої маси) та позитивним контролем (0,46 ± 0,02 мг/г сухої маси; рис. 4F). Загалом, ці результати свідчать про те, що L-орнітин не є фітотоксичним для оброблених бобових культур і навіть може стимулювати їхній ріст.
Рис. 4. Вплив екзогенного застосування L-орнітину на характеристики росту та фотосинтетичні пігменти листя квасолі, інфікованого Sclerotinia sclerotiorum, в тепличних умовах. (A) Висота рослини (см), (B) Кількість гілок на рослину, (C) Кількість листків на рослину, (D) Вміст хлорофілу a (мг г-1 сухої маси), (E) Вміст хлорофілу b (мг г-1 сухої маси), (F) Загальний вміст каротиноїдів (мг г-1 сухої маси). Значення є середнім ± стандартним відхиленням п'яти біологічних повторностей (n = 5). Різні літери вказують на статистично значущі відмінності між варіантами обробки (p < 0,05).
Гістохімічна локалізація активних форм кисню (ROS; виражені як перекис водню [H2O2]) та вільних радикалів (виражених як супероксидні аніони [O2•−]) in situ показала, що екзогенне застосування L-орнітину (250 мг/л) значно зменшило накопичення H2O2 (96,05 ± 5,33 нмоль·г−1 FW; рис. 5A) та O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль·г−1 FW; рис. 5B) порівняно з накопиченням як у необроблених інфікованих рослинах (173,31 ± 12,06 та 149,35 ± 7,94 нмоль·г−1 FW відповідно), так і в рослинах, оброблених 50 мг/л комерційного фунгіциду Rizolex-T (170,12 ± 9,50 та 157,00 ± 7,81 нмоль·г−1 fr wt відповідно) через 72 години. Високі рівні H2O2 та O2•− накопичувалися під дією високотемпературної термічної обробки (рис. 5A, B). Аналогічно, аналіз малонового діальдегіду (MDA) на основі TCA показав, що рослини квасолі, інфіковані S. sclerotiorum, накопичували вищі рівні MDA (113,48 ± 10,02 нмоль/г сухої ваги) у своєму листі (рис. 5C). Однак екзогенне застосування L-орнітину значно знизило перекисне окислення ліпідів, про що свідчить зниження вмісту MDA в оброблених рослинах (33,08 ± 4,00 нмоль/г сухої ваги).
Рис. 5. Вплив екзогенного застосування L-орнітину на основні маркери оксидативного стресу та неферментативні механізми антиоксидантного захисту у листі квасолі, інфікованому S. sclerotiorum, через 72 години після інфікування в тепличних умовах. (A) Пероксид водню (H2O2; нмоль г−1 FW) при 72 год/т, (B) супероксид-аніон (O2•−; нмоль г−1 FW) при 72 год/т, (C) малоновий діальдегід (MDA; нмоль г−1 FW) при 72 год/т, (D) загальний вміст розчинних фенолів (мг GAE г−1 FW) при 72 год/т, (E) загальний вміст розчинних флавоноїдів (мг RE г−1 FW) при 72 год/т, (F) загальний вміст вільних амінокислот (мг г−1 FW) при 72 год/т та (G) вміст проліну (мг г−1 FW) при 72 год/т. Значення представляють середнє значення ± стандартне відхилення (середнє ± SD) 5 біологічних повторностей (n = 5). Різні літери вказують на статистично значущі відмінності між методами лікування (p < 0,05).