Різні теорії захисту рослин надають важливі теоретичні рекомендації для пояснення закономірностей спеціалізованого метаболізму рослин, але їхні ключові прогнози ще потребують перевірки. Тут ми використовували неупереджений тандемний мас-спектрометрічний (MS/MS) аналіз для систематичного дослідження метаболому атенуйованих штамів тютюну від окремих рослин до популяцій та близькоспоріднених видів, а також обробили велику кількість теорій мас-спектрометричних ознак на основі складних спектрів в інформації. Структура для перевірки ключових прогнозів теорій оптимального захисту (OD) та рухомої цілі (MT). Інформаційний компонент метаболоміки рослин узгоджується з теорією OD, але суперечить основному прогнозу теорії MT щодо динаміки метаболоміки, спричиненої травоїдними тваринами. Від мікро- до макроеволюційного рівня сигнал жасмонату був визначений як основний детермінант OD, тоді як сигнал етилену забезпечував точне налаштування специфічної для травоїдної тварини відповіді, анотованої молекулярною мережею MS/MS.
Спеціальні метаболіти з різноманітною структурою є основними учасниками адаптації рослин до навколишнього середовища, особливо в захисті від ворогів (1). Дивовижна диверсифікація спеціального метаболізму, виявленого в рослинах, стимулювала десятиліття поглиблених досліджень його численних аспектів екологічних функцій та сформувала довгий список теорій захисту рослин, які є еволюційним та екологічним розвитком взаємодії рослин і комах. Емпіричні дослідження надають важливі рекомендації (2). Однак ці теорії захисту рослин не йшли нормативним шляхом гіпотетичного дедуктивного мислення, в якому ключові прогнози були на одному рівні аналізу (3) та були перевірені експериментально для просування наступного циклу теоретичної розробки (4). Технічні обмеження обмежують збір даних конкретними метаболічними категоріями та виключають комплексний аналіз спеціалізованих метаболітів, тим самим запобігаючи міжкатегорійним порівнянням, які є важливими для теоретичної розробки (5). Відсутність комплексних даних метаболіки та спільної валюти для порівняння робочого процесу обробки метаболічного простору між різними групами рослин перешкоджає науковій зрілості цієї галузі.
Найновіші розробки в галузі метаболоміки тандемної мас-спектрометрії (MS/MS) можуть всебічно характеризувати метаболічні зміни всередині та між видами даної системної клади, а також можуть бути поєднані з обчислювальними методами для розрахунку структурної подібності між цими складними сумішами. Попередні знання хімії (5). Поєднання передових технологій в аналізі та обчисленнях забезпечує необхідну основу для довгострокової перевірки багатьох прогнозів, зроблених екологічними та еволюційними теоріями метаболічного різноманіття. Шеннон (6) вперше представив теорію інформації у своїй фундаментальній статті в 1948 році, заклавши основу для математичного аналізу інформації, який використовувався в багатьох галузях, окрім її початкового застосування. У геноміці теорія інформації була успішно застосована для кількісної оцінки консервативної інформації про послідовності (7). У дослідженнях транскриптоміки теорія інформації аналізує загальні зміни в транскриптомі (8). У попередніх дослідженнях ми застосували статистичну основу теорії інформації до метаболоміки для опису метаболічної експертизи на рівні тканин у рослин (9). Тут ми поєднуємо робочий процес на основі MS/MS зі статистичною основою теорії інформації, що характеризується метаболічною різноманітністю в єдиній валюті, щоб порівняти ключові прогнози теорії захисту рослин метаболома, індукованого травоїдними тваринами.
Теоретичні основи захисту рослин зазвичай є взаємодоповнюючими та можуть бути розділені на дві категорії: ті, що намагаються пояснити розподіл специфічних для рослин метаболітів на основі захисних функцій, таких як теорія оптимального захисту (ОЗ) (10), теорія рухомої цілі (РЦ) (11) та теорія зовнішнього вигляду (ЗПО) (12), тоді як інші шукають механічні пояснення того, як зміни в доступності ресурсів впливають на ріст рослин та накопичення спеціалізованих метаболітів, таких як вуглець: гіпотеза балансу поживних речовин (13), гіпотеза швидкості росту (14) та гіпотеза рівноваги росту та диференціації (15). Ці два набори теорій знаходяться на різних рівнях аналізу (4). Однак дві теорії, що стосуються захисних функцій на функціональному рівні, домінують у розмовах про конститутивний та індуцибельний захист рослин: теорія ОЗ, яка припускає, що рослини інвестують у свій дорогий хімічний захист лише тоді, коли це необхідно, наприклад, коли їх поглинають. Коли трав'яна тварина атакує, тому, відповідно до можливості майбутньої атаки, призначається сполука із захисною функцією (10); Гіпотеза МТ передбачає, що немає осі спрямованої зміни метаболітів, але метаболіт змінюється випадковим чином, створюючи таким чином можливість перешкоджати метаболічному «руху цілі» атакуючих травоїдних. Іншими словами, ці дві теорії роблять протилежні прогнози щодо метаболічної перебудови, яка відбувається після атаки травоїдних: зв'язок між односпрямованим накопиченням метаболітів із захисною функцією (ОЗ) та неспрямованими метаболічними змінами (НМЗ) (11).
Гіпотези OD та MT включають не лише індуковані зміни в метаболомі, але й екологічні та еволюційні наслідки накопичення цих метаболітів, такі як адаптивні витрати та вигоди від цих метаболічних змін у конкретному екологічному середовищі (16). Хоча обидві гіпотези визнають захисну функцію спеціалізованих метаболітів, які можуть бути дорогими або ні, ключове передбачення, яке відрізняє гіпотези OD та MT, полягає у спрямованості індукованих метаболічних змін. Передбачення теорії OD отримало найбільшу експериментальну увагу досі. Ці тести включають вивчення прямих або непрямих захисних функцій різних тканин конкретних сполук у теплицях та природних умовах, а також зміни стадії розвитку рослин (17-19). Однак, досі, через відсутність робочого процесу та статистичної бази для глобального комплексного аналізу метаболічного різноманіття будь-якого організму, основна різниця між двома теоріями (тобто напрямок метаболічних змін) залишається неперевіреною. Тут ми надаємо такий аналіз.
Однією з найважливіших характеристик рослинно-специфічних метаболітів є їх надзвичайна структурна різноманітність на всіх рівнях, від окремих рослин, популяцій до подібних видів (20). Багато кількісних змін у спеціалізованих метаболітах можна спостерігати на рівні популяції, тоді як сильні якісні відмінності зазвичай зберігаються на видовому рівні (20). Таким чином, метаболічне різноманіття рослин є основним аспектом функціонального різноманіття, що відображає адаптивність до різних ніш, особливо тих, що мають різні можливості вторгнення специфічних комах та звичайних травоїдних (21). З моменту публікації новаторської статті Френкеля (22) про причини існування рослинно-специфічних метаболітів, взаємодія з різними комахами розглядається як важливий фактор селекційного тиску, і вважається, що ця взаємодія формувала рослини під час еволюції. Метаболічний шлях (23). Міжвидові відмінності в різноманітності спеціалізованих метаболітів також можуть відображати фізіологічний баланс, пов'язаний з конститутивним та індукованим захистом рослин від стратегій травоїдних, оскільки ці два види часто негативно корелюють один з одним (24). Хоча підтримувати хороший захист у будь-який час може бути корисним, своєчасні метаболічні зміни, пов'язані із захистом, забезпечують явні переваги, дозволяючи рослинам розподіляти цінні ресурси на інші фізіологічні інвестиції (19, 24) та уникати необхідності симбіозу. Побічна шкода (25). Крім того, ці реорганізації спеціалізованих метаболітів, спричинені комахами-травоїдними, можуть призвести до деструктивного розподілу в популяції (26) та можуть відображати прямі показники суттєвих природних змін у сигналі жасмонової кислоти (JA), який може підтримуватися в популяції. Високі та низькі сигнали JA є компромісами між захистом від травоїдних та конкуренцією з певними видами (27). Крім того, спеціалізовані шляхи біосинтезу метаболітів зазнають швидких втрат та трансформацій під час еволюції, що призведе до нерівномірного розподілу метаболізму серед близькоспоріднених видів (28). Ці поліморфізми можуть швидко встановлюватися у відповідь на зміну структури травоїдних (29), що означає, що коливання спільнот травоїдних є ключовим фактором, що зумовлює метаболічну гетерогенність.
Тут ми конкретно вирішили такі проблеми. (I) Як травоїдна комаха переконфігурує метаболом рослини? (Ii) Які основні інформаційні компоненти метаболічної пластичності можна кількісно визначити для перевірки прогнозів теорії довгострокового захисту? (Iii) Чи слід перепрограмувати метаболом рослини унікальним для атакуючого способом, і якщо так, то яку роль відіграє рослинний гормон у формуванні специфічної метаболічної відповіді, і які метаболіти сприяють видовій специфічності захисту? (Iv) Оскільки прогнози, зроблені багатьма теоріями захисту, можна поширити на всі рівні біологічних тканин, ми запитали, наскільки послідовною є спричинена метаболічна відповідь від внутрішнього порівняння до міжвидового порівняння? З цією метою ми систематично вивчали метаболом листя тютюну, який є екологічною модельною рослиною з багатим спеціалізованим метаболізмом і ефективний проти личинок двох місцевих травоїдних, Lepidoptera Datura (Ms) (дуже агресивні, переважно вживаються в їжу). На Solanaceae та Spodoptera littoralis (Sl) бавовняні черви є своєрідним «родом» з рослинами-господарями Solanaceae та іншими господарями інших родів та родин. Ми проаналізували спектр метаболоміки MS/MS та витягли статистичні дескриптори теорії інформації для порівняння теорій оптичної щільності (OD) та механічної обробки (MT). Створили карти специфічності, щоб виявити ідентичність ключових метаболітів. Аналіз було поширено на місцеву популяцію N. nasi та близькоспоріднених видів тютюну для подальшого аналізу коваріації між сигналізацією рослинних гормонів та індукцією OD.
Щоб отримати загальну карту пластичності та структури метаболому листя травоїдного тютюну, ми використали раніше розроблений робочий процес аналізу та розрахунку для комплексного збору та деконволюції даних високої роздільної здатності, незалежних від спектрів MS/MS з рослинних екстрактів (9). Цей недиференційований метод (так званий MS/MS) може створювати ненадлишкові спектри сполук, які потім можна використовувати для всіх аналізів на рівні сполук, описаних тут. Ці деконволютовані рослинні метаболіти бувають різних типів, що складаються від сотень до тисяч метаболітів (близько 500-1000-s/MS/MS тут). Тут ми розглядаємо метаболічну пластичність в рамках теорії інформації та кількісно визначаємо різноманітність та професіоналізм метаболому на основі ентропії Шеннона розподілу метаболічних частот. Використовуючи раніше реалізовану формулу (8), ми розрахували набір показників, які можна використовувати для кількісної оцінки різноманітності метаболому (індикатор Hj), спеціалізації метаболічного профілю (індикатор δj) та метаболічної специфічності окремого метаболіту (індикатор Si). Крім того, ми застосували індекс відносної пластичності відстані (RDPI) для кількісної оцінки індуцибельності метаболому травоїдних (Рисунок 1A) (30). У рамках цієї статистичної структури ми розглядаємо спектр MS/MS як основну інформаційну одиницю та обробляємо відносну чисельність MS/MS у карту розподілу частот, а потім використовуємо ентропію Шеннона для оцінки різноманітності метаболому на її основі. Спеціалізація метаболому вимірюється середньою специфічністю окремого спектру MS/MS. Таким чином, збільшення чисельності деяких класів MS/MS після індукції травоїдних трансформується в спектральну індуцибельність, RDPI та спеціалізацію, тобто збільшення індексу δj, оскільки виробляється більше спеціалізованих метаболітів та утворюється високий індекс Si. Зниження індексу різноманітності Hj відображає те, що або зменшується кількість згенерованих MS/MS, або розподіл частот профілю змінюється в менш рівномірному напрямку, одночасно зменшуючи його загальну невизначеність. За допомогою розрахунку індексу Si можна виділити, які MS/MS індукуються певними травоїдними тваринами, і навпаки, які MS/MS не реагують на індукцію, що є ключовим показником для розрізнення прогнозування MT та OD.
(A) Статистичні дескриптори, що використовуються для індукованості даних MS/MS (RDPI), різноманітності (індекс Hj), спеціалізації (індекс δj) та специфічності метаболітів (індекс Si) у травоїдних (H1 до Hx). Збільшення ступеня спеціалізації (δj) вказує на те, що в середньому буде вироблятися більше специфічних для травоїдних метаболітів, тоді як зменшення різноманітності (Hj) вказує на зменшення виробництва метаболітів або нерівномірний розподіл метаболітів на карті розподілу. Значення Si оцінює, чи є метаболіт специфічним для заданого стану (тут, травоїдних), чи навпаки, підтримується на тому ж рівні. (B) Концептуальна діаграма прогнозування теорії захисту з використанням осі теорії інформації. Теорія OD передбачає, що атака травоїдних збільшить кількість метаболітів захисту, тим самим збільшуючи δj. Водночас Hj зменшується, оскільки профіль реорганізується в бік зменшення невизначеності метаболічної інформації. Теорія MT передбачає, що атака травоїдних спричинить ненаправлені зміни в метаболомі, тим самим збільшуючи Hj як показник підвищеної невизначеності метаболічної інформації та спричиняючи випадковий розподіл Si. Ми також запропонували змішану модель, найкращий МТ, в якій деякі метаболіти з вищими захисними значеннями будуть особливо підвищені (високе значення Si), тоді як інші демонструватимуть випадкові реакції (нижче значення Si).
Використовуючи дескриптори теорії інформації, ми інтерпретуємо теорію органорозчинності (ОР), щоб передбачити, що індуковані травоїдними змінами спеціальних метаболітів у неіндукованому конститутивному стані призведуть до (i) збільшення метаболічної специфічності (індексу Si), що зумовлює метабономічну специфічність (індекс δj) (збільшення) певних груп спеціальних метаболітів з вищим захисним значенням, та (ii) зменшення різноманітності метаболому (індекс Hj) через зміну розподілу метаболічної частоти в бік розподілу лептинових тілець. На рівні окремого метаболіту очікується впорядкований розподіл Si, де метаболіт збільшуватиме значення Si відповідно до свого захисного значення (Рисунок 1B). У цьому сенсі ми пояснюємо теорію МТ, щоб передбачити, що збудження призведе до (i) ненаправлених змін у метаболітах, що призведе до зменшення індексу δj, та (ii) збільшення індексу Hj через збільшення метаболічної невизначеності або випадковості, яку можна кількісно визначити ентропією Шеннона у формі узагальненого різноманіття. Що стосується метаболічного складу, теорія МТ передбачає випадковий розподіл Si. Беручи до уваги, що деякі метаболіти перебувають у певних умовах за певних умов, а інші умови не перебувають у певних умовах, і їх захисна цінність залежить від середовища, ми також запропонували модель змішаного захисту, в якій δj та Hj розподілені вздовж Si у двох напрямках. Збільшення Si у всіх напрямках, лише певні групи метаболітів, які мають вищі захисні значення, будуть особливо збільшувати Si, тоді як інші матимуть випадковий розподіл (Рисунок 1B).
Щоб перевірити прогноз переосмисленої теорії захисту на осі дескриптора теорії інформації, ми створили личинки травоїдних тварин експертного (Ms) або універсального (Sl) типу на листках Nepenthes pallens (Рисунок 2A). Використовуючи MS/MS аналіз, ми отримали 599 ненадлишкових MS/MS спектрів (файл даних S1) з метанольних екстрактів тканини листя, зібраних після годування гусениць. Використання індексів RDPI, Hj та δj для візуалізації реконфігурації інформаційного вмісту у файлах конфігурації MS/MS виявляє цікаві закономірності (Рисунок 2B). Загальна тенденція полягає в тому, що, як описано в інформаційному дескрипторі, оскільки гусениці продовжують їсти листя, ступінь усієї метаболічної реорганізації з часом зростає: через 72 години після того, як травоїдна тварина поїла листя, RDPI значно зростає. Порівняно з непошкодженим контролем, Hj значно знизився, що було пов'язано зі збільшенням ступеня спеціалізації метаболічного профілю, який був кількісно визначений індексом δj. Ця очевидна тенденція узгоджується з прогнозами теорії органорозчинної секреції (OD), але суперечить основним прогнозам теорії механічної обробки (MT), яка вважає, що випадкові (ненаправлені) зміни рівнів метаболітів використовуються як захисний камуфляж (Рисунок 1B). Хоча вміст еліситора ротової секреції (OS) та харчова поведінка цих двох травоїдних різняться, їхнє пряме годування призвело до подібних змін напрямків Hj та δj протягом 24-годинного та 72-годинного періодів збору врожаю. Єдина різниця спостерігалася через 72 години після початку прямого питомого харчування (RDPI). Порівняно з метаболізмом, спричиненим годуванням з міді, загальний метаболізм, індукований годуванням з сиропом, був вищим.
(A) План експерименту: травоїдних свиней звичайної (S1) або експертів (Ms) годують опрісненим листям рослин-глечиків, тоді як для імітації травоїдності для обробки проколів стандартизованих позицій листя використовується OS Ms (W + OSMs). Личинки S1 (W + OSSl) або вода (W + W). Контроль (C) – це непошкоджений листок. (B) Індекс індуктивності (RDPI порівняно з контрольною діаграмою), різноманітності (індекс Hj) та спеціалізації (індекс δj), розрахований для карти спеціальних метаболітів (599 MS/MS; файл даних S1). Зірочки вказують на значні відмінності між прямим годуванням травоїдними тваринами та контрольною групою (t-критерій Стьюдента з парним t-критерієм, *P<0,05 та ***P<0,001). ns – неважливо. (C) Індекс роздільної здатності за часом основного (синій блок, амінокислота, органічна кислота та цукор; файл даних S2) та спектру спеціальних метаболітів (червоний блок 443 MS/MS; файл даних S1) після імітації обробки травоїдними рослинами. Кольорова смуга стосується 95% довірчого інтервалу. Зірочка вказує на значну різницю між варіантом обробки та контролем [квадратичний дисперсійний аналіз (ANOVA), а потім чесно значуща різниця Тьюкі (HSD) для post hoc множинних порівнянь, *P<0,05, **P<0,01 та *** P <0,001]. (D) Спеціалізація діаграм розсіювання та профілів спеціальних метаболітів (повторні зразки з різними обробками).
Щоб дослідити, чи відображається ремоделювання, індуковане травоїдними тваринами, на змінах рівня окремих метаболітів, ми спочатку зосередилися на метаболітах, які раніше вивчалися в листках Nepenthes pallens з доведеною стійкістю до травоїдних. Фенольні аміди - це кон'югати гідроксициннамід-поліамін, які накопичуються під час процесу травоїдності комах і, як відомо, знижують їх продуктивність (32). Ми дослідили попередники відповідної MS/MS та побудували їхні кумулятивні кінетичні криві (Рисунок S1). Не дивно, що фенольні похідні, які не беруть безпосередньої участі в захисті від травоїдних, такі як хлорогенова кислота (CGA) та рутин, знижуються після травоїдності. Навпаки, травоїдні можуть робити феноламіди дуже потужними. Безперервне годування двох травоїдних призвело до майже однакового спектру збудження феноламідів, і ця закономірність була особливо очевидною для de novo синтезу феноламідів. Таке ж явище спостерігатиметься при дослідженні шляху 17-гідроксигеранілнонандіолових дитерпенових глікозидів (17-HGL-DTG), який продукує велику кількість ациклічних дитерпенів з ефективними антитравоїдними функціями (33), з яких годування Ms Sl запускало подібний профіль експресії (Рисунок S1).
Можливим недоліком експериментів з прямим годуванням травоїдними є різниця в швидкості споживання листя та часі годування травоїдними, що ускладнює усунення специфічних для травоїдних ефектів, спричинених ранами та травоїдними. Щоб краще вирішити видову специфічність індукованої метаболічної реакції листя у травоїдних, ми моделювали годування личинок Ms та Sl, негайно застосовуючи свіжозібраний OS (OSM та OSS1) до стандартного проколу W у відповідних положеннях листя. Ця процедура називається обробкою W + OS, і вона стандартизує індукцію шляхом точного визначення часу початку реакції, викликаної травоїдною твариною, без виникнення побічних ефектів різниці у швидкості або кількості втрати тканин (Рисунок 2A) (34). Використовуючи конвеєр аналізу та розрахунків MS/MS, ми отримали 443 спектри MS/MS (файл даних S1), які перекривалися зі спектрами, раніше зібраними з експериментів з прямим годуванням. Аналіз теорії інформації цього набору даних MS/MS показав, що перепрограмування спеціалізованих на листі метаболомів шляхом моделювання травоїдних показало специфічні для OS стимули (Рисунок 2C). Зокрема, порівняно з обробкою OSS1, OSM викликав посилення спеціалізації метаболому через 4 години. Варто зазначити, що порівняно з експериментальним набором даних прямого годування травоїдними, метаболічна кінетика, візуалізована у двовимірному просторі з використанням координат Hj та δj, а спрямованість спеціалізації метаболому у відповідь на змодельоване годування травоїдними з часом зростала послідовно (Рисунок 2D). Водночас ми кількісно визначили вміст амінокислот, органічних кислот та цукрів (файл даних S2), щоб дослідити, чи це цілеспрямоване збільшення експертизи метаболому зумовлене реконфігурацією центрального вуглецевого метаболізму у відповідь на змодельоване годування травоїдними (Рисунок S2). Щоб краще пояснити цю закономірність, ми додатково контролювали кінетику метаболічного накопичення раніше обговорюваних шляхів феноламіду та 17-HGL-DTG. Специфічна для OS індукція травоїдних трансформується в диференціальну схему перебудови в межах метаболізму феноламіду (Рисунок S3). Фенольні аміди, що містять кумаринові та кофеїльні фрагменти, переважно індукуються OSS1, тоді як OSM запускають специфічну індукцію ферулільних кон'югатів. Для шляху 17-HGL-DTG було виявлено диференціальну індукцію OS продуктами малонілювання та дималонілювання нижче за течією (Рисунок S3).
Далі ми вивчали пластичність транскриптому, індуковану OS, використовуючи набір даних мікрочипів з часовим плином, який імітує використання OSM для обробки листя розеточних рослин у травоїдних. Кінетика відбору проб в основному перетинається з кінетикою, використаною в цьому дослідженні метаболоміки (35). Порівняно з реконфігурацією метаболому, в якій метаболічна пластичність особливо зростає з часом, ми спостерігаємо тимчасові сплески транскрипції в листках, індуковані Ms, де індуцибельність транскриптому (RDPI) та спеціалізація (δj) знаходяться на рівні 1. Спостерігалося значне збільшення годин та різноманітності (Hj) у цей момент часу, експресія BMP1 значно знижувалася, після чого відбувалася релаксація спеціалізації транскриптому (Рисунок S4). Сімейства метаболічних генів (такі як P450, глікозилтрансфераза та BAHD ацилтрансфераза) беруть участь у процесі складання спеціальних метаболітів зі структурних одиниць, отриманих в результаті первинного метаболізму, дотримуючись вищезгаданої ранньої моделі високої спеціалізації. Як приклад було проаналізовано шлях фенілаланіну. Аналіз підтвердив, що основні гени метаболізму феноламіду у травоїдних тварин значною мірою індукуються ОС порівняно з рослинами, які не отримують метаболізм, і тісно пов'язані між собою за характером експресії. Транскрипційний фактор MYB8 та структурні гени PAL1, PAL2, C4H та 4CL у вищезазначеному шляху показали ранню ініціацію транскрипції. Ацилтрансферази, що відіграють роль у кінцевому складанні феноламіду, такі як AT1, DH29 та CV86, демонструють тривалий характер підвищеної регуляції (Рисунок S4). Наведені вище спостереження вказують на те, що рання ініціація спеціалізації транскриптома та пізніше посилення спеціалізації метаболоміки є пов'язаним режимом, що може бути пов'язано з синхронною регуляторною системою, яка ініціює потужну захисну реакцію.
Реконфігурація сигналізації рослинних гормонів діє як регуляторний шар, який інтегрує інформацію травоїдних для перепрограмування фізіології рослин. Після моделювання травоїдних тварин ми виміряли кумулятивну динаміку ключових категорій рослинних гормонів та візуалізували часову коекспресію між ними [коефіцієнт кореляції Пірсона (PCC) > 0,4] (Рисунок 3A). Як і очікувалося, рослинні гормони, пов'язані з біосинтезом, пов'язані в мережі коекспресії рослинних гормонів. Крім того, метаболічна специфічність (індекс Si) відображається в цій мережі, щоб виділити рослинні гормони, індуковані різними обробками. Визначено дві основні області специфічної відповіді травоїдних тварин: одна знаходиться в кластері JA, де JA (його біологічно активна форма JA-Ile) та інші похідні JA показують найвищий показник Si; інша - етилен (ET). Гіберелін показав лише помірне збільшення специфічності для травоїдних, тоді як інші рослинні гормони, такі як цитокінін, ауксин та абсцизова кислота, мали низьку індукційну специфічність для травоїдних. Порівняно з використанням лише W + W, посилення пікового значення похідних JA шляхом застосування OS (W + OS) може бути фактично перетворено на сильний специфічний індикатор JA. Несподівано, відомо, що OSM та OSS1 з різним вмістом еліситора викликають подібне накопичення JA та JA-Ile. На відміну від OSS1, OSM специфічно та сильно індукується OSM, тоді як OSS1 не посилює реакцію базальних ран (Рисунок 3B).
(A) Аналіз мережі коекспресії на основі розрахунку PCC для моделювання кінетики накопичення гормонів рослин, індукованих травоїдними тваринами. Вузол представляє один рослинний гормон, а розмір вузла представляє індекс Si, специфічний для рослинного гормону між обробками. (B) Накопичення JA, JA-Ile та ET у листках, спричинене різними обробками, позначено різними кольорами: абрикосовий, W + OSM; синій, W + OSSl; чорний, W + W; сірий, C (контроль). Зірочки вказують на значні відмінності між обробкою та контролем (двофакторний ANOVA з подальшим постфакторним множинним порівнянням Tukey HSD, *** P <0,001). Теоретично-інформаційний аналіз (C)697 MS/MS (файл даних S1) у біосинтезі JA та спектрі порушеного сприйняття (irAOC та irCOI1) та (D)585 MS/MS (файл даних S1) в ETR1 з порушеним сигналом ET. Дві імітовані обробки травоїдними тваринами активували лінії рослин та контрольні рослини з порожнім транспортним засобом (EV). Зірочки вказують на суттєві відмінності між обробкою W+OS та неушкодженим контролем (двофакторний дисперсійний аналіз ANOVA з подальшим постфактумним множинним порівнянням Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 та ***P<0,001). (E) Розсіяні графіки розсіяної опозиції до спеціалізації. Кольори представляють різні генетично модифіковані штами; символи представляють різні методи обробки: трикутник, W + OSS1; прямокутник, W + OSM; коло C
Далі ми використовуємо генетично модифікований штам атенуйованих Nepenthes (irCOI1 та sETR1) на ключових етапах біосинтезу JA та ET (irAOC та irACO) та сприйняття (irCOI1 та sETR1) для аналізу метаболізму цих двох рослинних гормонів у травоїдних. Відносний внесок репрограмування. Відповідно до попередніх експериментів, ми підтвердили індукцію OS травоїдних у рослин з порожніми носіями (EV) (Рисунок 3, C-D) та загальне зниження індексу Hj, спричинене OSM, тоді як індекс δj збільшився. Реакція є більш вираженою, ніж реакція, викликана OSS1. Дволінійний графік з використанням Hj та δj як координат показує специфічну дерегуляцію (Рисунок 3E). Найбільш очевидною тенденцією є те, що у штамах, яким бракує сигналу JA, різноманітність метаболому та зміни спеціалізації, спричинені травоїдними, майже повністю усуваються (Рисунок 3C). На противагу цьому, тихе сприйняття ET у рослин sETR1, хоча загальний вплив на зміни метаболізму травоїдних значно нижчий, ніж вплив сигналізації JA, послаблює різницю в індексах Hj та δj між збудженнями OSM та OSS1 (Рисунок 3D та Рисунок S5). Це вказує на те, що, окрім основної функції передачі сигналу JA, передача сигналу ET також служить для точного налаштування видоспецифічної метаболічної відповіді травоїдних. Відповідно до цієї функції точного налаштування, не спостерігалося змін у загальній індуктивності метаболому у рослин sETR1. З іншого боку, порівняно з рослинами sETR1, рослини irACO індукували подібну загальну амплітуду метаболічних змін, спричинених травоїдними, але показали значно різні показники Hj та δj між стимуляціями OSM та OSS1 (Рисунок S5).
Для того, щоб ідентифікувати спеціалізовані метаболіти, які мають важливий внесок у видову реакцію травоїдних тварин, та точно налаштувати їх виробництво за допомогою сигналів ET, ми використали раніше розроблений метод структурної МС/МС. Цей метод базується на методі бікластеризації для повторного виведення метаболічної родини з фрагментів МС/МС [нормалізований скалярний добуток (НСД)] та оцінки подібності на основі нейтральних втрат (НЛ). Набір даних МС/МС, побудований шляхом аналізу трансгенних ліній ЕТ, дав 585 МС/МС (файл даних S1), які були розділені шляхом кластеризації їх у сім основних модулів МС/МС (M) (Рисунок 4A). Деякі з цих модулів щільно упаковані раніше охарактеризованими спеціальними метаболітами: наприклад, M1, M2, M3, M4 та M7 багаті на різні фенольні похідні (M1), флавоноїдні глікозиди (M2), ацильні цукри (M3 та M4) та 17-HGL-DTG (M7). Крім того, розраховується метаболічна специфічна інформація (індекс Si) окремого метаболіту в кожному модулі, і його розподіл Si можна побачити інтуїтивно. Коротше кажучи, спектри MS/MS, що демонструють високу специфічність до травоїдності та генотипу, характеризуються високими значеннями Si, а статистика ексцесу вказує на розподіл хутра на правому куті хвоста. Один такий розподіл щільного колоїду був виявлений у M1, де феноламід показав найвищу частку Si (Рисунок 4B). Згаданий раніше травоїдний індукований 17-HGL-DTG у M7 показав помірний бал Si, що вказує на помірний ступінь диференціальної регуляції між двома типами OS. Навпаки, більшість конститутивно продукованих спеціалізованих метаболітів, таких як рутин, CGA та ацильні цукри, мають одні з найнижчих балів Si. Для кращого дослідження структурної складності та розподілу Si між спеціальними метаболітами для кожного модуля була побудована молекулярна мережа (Рисунок 4B). Важливим передбаченням теорії OD (підсумовано на рисунку 1B) є те, що реорганізація спеціальних метаболітів після травоїдних комах повинна призвести до односторонніх змін у метаболітах з високою захисною цінністю, особливо шляхом збільшення їх специфічності (на відміну від випадкового розподілу). Режим) Захисний метаболіт, передбачений теорією MT. Більшість фенольних похідних, накопичених в M1, функціонально пов'язані зі зниженням продуктивності комах (32). Порівнюючи значення Si в метаболітах M1 між індукованим листям та складовим листям контрольних рослин EV через 24 години, ми спостерігали, що метаболічна специфічність багатьох метаболітів після травоїдних комах має значну тенденцію до зростання (рисунок 4C). Питоме збільшення значення Si було виявлено лише в захисних феноламідах, але збільшення значення Si не було виявлено в інших фенолах та невідомих метаболітах, що співіснують у цьому модулі. Це спеціалізована модель, яка пов'язана з теорією OD. Основні передбачення метаболічних змін, спричинених травоїдними, є узгодженими. Щоб перевірити, чи була ця особливість феноламідного спектру індукована OS-специфічним ET, ми побудували графік індексу метаболіту Si та викликали диференціальне значення експресії між OSM та OSS1 у генотипах EV та sETR1 (Рисунок 4D). У sETR1 різниця, індукована фенамідом, між OSM та OSS1 була значно зменшена. Метод бікластеризації також був застосований до даних MS/MS, зібраних у штамів з недостатньою кількістю JA, щоб зробити висновок про основні модулі MS/MS, пов'язані з метаболічною спеціалізацією, регульованою JA (Рисунок S6).
(A) Результати кластеризації 585 MS/MS на основі спільного фрагмента (подібність NDP) та спільної втрати нейтральних ланок (подібність NL) призводять до того, що модуль (M) відповідає відомому сімейству сполук або невідомому чи погано метаболізованому складу метаболітів. Поруч із кожним модулем показано розподіл специфічних (Si) метаболітів (MS/MS). (B) Модульна молекулярна мережа: Вузли представляють MS/MS та ребра, NDP (червоний) та NL (синій) показники MS/MS (порогове значення > 0,6). Градуйований індекс специфічності метаболітів (Si) забарвлений на основі модуля (ліворуч) та зіставлений з молекулярною мережею (праворуч). (C) Модуль M1 рослини EV у конститутивному (контрольному) та індукованому стані (модельована травоїдна тварина) через 24 години: діаграма молекулярної мережі (значення Si – розмір вузла, захисний феноламід виділено синім кольором). (D) Діаграма молекулярної мережі M1 спектральної лінії sETR1 з порушеним сприйняттям EV та ET: фенольна сполука, представлена ​​зеленим круглим вузлом, та значна різниця (значення P) між обробками W + OSM та W + OSS1 як розмір вузла. CP, N-кофеоїл-тирозин; CS, N-кофеоїл-спермідин; FP, N-феруловий естер сечової кислоти; FS, N-феруліл-спермідин; CoP, N', N “-кумароліл-тирозин; DCS, N', N”-дикафеоїл-спермідин; CFS, N', N”-кофеоїл, ферулоїл-спермідин; Lycium barbarum у вовчій ягоді Son; Nick. O-AS, O-ацильний цукор.
Ми також розширили аналіз з одного атенуйованого генотипу Nepenthes на природні популяції, де раніше були описані сильні внутрішньовидові зміни в рівнях JA у травоїдних тварин та рівнях специфічних метаболітів у природних популяціях (26). Використовуючи цей набір даних, ми охопили 43 зародкові плазми. Ці зародкові плазми складаються зі 123 видів рослин N. pallens. Ці рослини були взяті з насіння, зібраного в різних природних середовищах існування в Юті, Неваді, Аризоні та Каліфорнії (Рисунок S7), ми розрахували різноманітність метаболому (тут називається популяційним рівнем) (β-різноманітність) та спеціалізацію, спричинену OSM. Відповідно до попередніх досліджень, ми спостерігали широкий діапазон метаболічних змін вздовж осей Hj та δj, що вказує на те, що зародкові плазми мають значні відмінності в пластичності своїх метаболічних реакцій на травоїдних тварин (Рисунок S7). Така організація нагадує попередні спостереження щодо динамічного діапазону змін JA, спричинених травоїдними тваринами, і зберегла дуже високе значення в одній популяції (26, 36). Використовуючи JA та JA-Ile для перевірки загальної кореляції рівнів між Hj та δj, ми виявили значну позитивну кореляцію між JA та індексом різноманітності та спеціалізації метаболому β (рисунок S7). Це свідчить про те, що індукована травоїдними тваринами гетерогенність в індукції JA, виявлена ​​на рівні популяції, може бути зумовлена ​​ключовими метаболічними поліморфізмами, спричиненими відбором від комах-травоїдних.
Попередні дослідження показали, що види тютюну значно відрізняються за типом та відносною залежністю від індукованого та конститутивного метаболічного захисту. Вважається, що ці зміни в передачі сигналів проти травоїдних та захисних можливостей регулюються тиском популяції комах, життєвим циклом рослин та виробничими витратами на захист у ніші, де росте певний вид. Ми вивчали узгодженість ремоделювання метаболому листя, індукованого травоїдними тваринами шести видів Nicotiana, що походять з Північної та Південної Америки. Ці види тісно пов'язані з Nepenthes North America, а саме: Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, лінійний тютюн, тютюн (Nicotiana spegazzinii) та тютюновий листовий тютюн (Nicotiana obtusifolia) (Рисунок 5A) (37). Шість із цих видів, включаючи добре охарактеризований вид N. please, є однорічними рослинами клади petunia, а obtusifolia N. є багаторічними рослинами сестринської клади Trigonophyllae (38). Згодом індукцію W + W, W + OSM та W + OSS1 було проведено на цих семи видах для вивчення метаболічної перебудови живлення комах на видовому рівні.
(A) Філогенетичне дерево бутстрепу на основі методу максимальної правдоподібності [для синтезу ядерного глутаміну (38)] та географічного розподілу семи близькоспоріднених видів Nicotiana (різні кольори) (37). (B) Діаграма розсіювання спеціалізованої різноманітності для метаболічних профілів семи видів Nicotiana (939 MS/MS; файл даних S1). На видовому рівні різноманітність метаболому негативно корелює зі ступенем спеціалізації. Аналіз кореляції на видовому рівні між метаболічною різноманітністю, спеціалізацією та накопиченням JA показано на рисунку 2. S9. Колір, різні типи; трикутник, W + OSS1; прямокутник, W + OSM; (C) Динаміка JA та JA-Ile Nicotiana ранжована за амплітудою збудження OS (двофакторний ANOVA та Tukey HSD після множинного порівняння, * P <0,05, ** P <0,01 та * ** Для порівняння W + OS та W + W, P <0,001). Коробчаста діаграма (D) різноманітності та (E) спеціалізації кожного виду після моделювання травоїдної та метильної JA (MeJA). Зірочка вказує на значну різницю між W + OS та W + W або ланоліном плюс W (Lan + W) або Lan плюс MeJA (Lan + MeJa) та контролем Lan (двофакторний дисперсійний аналіз з подальшим постфакторним множинним порівнянням за методом Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 та ***P<0,001).
Використовуючи метод подвійного кластерування, ми ідентифікували 9 модулів з 939 MS/MS (файл даних S1). Склад MS/MS, реконфігурованих різними обробками, значно варіюється між різними модулями та видами (Рисунок S8). Візуалізація Hj (тут називається γ-різноманітністю видового рівня) та δj показує, що різні види агрегуються в дуже різні групи в метаболічному просторі, де поділ на видовому рівні зазвичай є більш вираженим, ніж збудження. За винятком N. linear та N. obliquus, вони демонструють широкий динамічний діапазон індукційних ефектів (Рисунок 5B). На противагу цьому, такі види, як N. purpurea та N. obtusifolia, мають менш очевидну метаболічну відповідь на обробку, але метаболом є більш різноманітним. Видоспецифічний розподіл індукованої метаболічної відповіді призвів до значної негативної кореляції між спеціалізацією та гамма-різноманітністю (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Зміни рівнів JA, індуковані OS, позитивно корелюють зі спеціалізацією метаболому та негативно корелюють з метаболічним гамма-різноманіттю, яке демонструє кожен вид (Рисунок 5B та Рисунок S9). Варто зазначити, що види, які розмовно називають видами «сигнальної реакції» на Рисунку 5C, такі як нематоди Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute та Nepenthes attenuated, викликали значні ознаки через 30 хвилин. Нещодавні спалахи JA та JA-Ile, специфічні для OS, тоді як інші бактерії, які називаються «сигнально нечутливими», такі як Nepenthes mills, Nepenthes powdery та N. obtusifolia, демонструють лише індукцію JA-Ile Edge без будь-якої специфічності до OS (Рисунок 5C). На метаболічному рівні, як згадувалося вище, для ослаблених Nepenthes сигнально-чутливі речовини демонстрували специфічність до OS та значно збільшували δj, одночасно знижуючи Hj. Цей специфічний для OS ефект праймінгу не був виявлений у видів, класифікованих як види, що не реагують на сигнал (Рисунок 5, D та E). Специфічні для ОС метаболіти частіше розподіляються між видами, що реагують на сигнали, і ці сигнальні кластери групуються з видами зі слабшими сигнальними відповідями, тоді як види зі слабшими сигнальними відповідями демонструють меншу взаємозалежність (Рисунок S8). Цей результат вказує на те, що специфічна для ОС індукція JA та специфічна для ОС реконфігурація метаболому нижче за течією пов'язані на видовому рівні.
Далі ми використали ланолінову пасту, що містить метилJA (MeJA), для обробки рослин, щоб дослідити, чи обмежуються ці режими зв'язування доступністю JA, що вноситься екзогенним JA, який буде знаходитися в цитоплазмі рослин. Швидка деетерифікація - це JA. Ми виявили таку ж тенденцію поступової зміни від видів, що реагують на сигнали, до видів, що не реагують на сигнали, спричинену безперервним надходженням JA (Рисунок 5, D та E). Коротше кажучи, обробка MeJA сильно перепрограмувала метаболоми лінійних нематод, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens та N. mikimotoi, що призвело до значного збільшення δj та зменшення Hj. Тільки N. purpurea показала збільшення δj, але не Hj. N. obtusifolia, яка, як було показано раніше, накопичує надзвичайно низькі рівні JA, також погано реагує на обробку MeJA з точки зору реконфігурації метаболому. Ці результати вказують на те, що продукція JA або передача сигналу фізіологічно обмежена у видів, що не реагують на сигнали. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми вивчили чотири види (N. pallens, N. mills, N. pink та N. microphylla), індуковані транскриптомами W + W, W + OSM та W + OSS1 (39). Відповідно до схеми ремоделювання метаболому, види добре розділені в просторі транскриптому, серед яких N. attenuated показав найвищий RDPI, індукований OS, тоді як N. gracilis мав найнижчий (Рисунок 6A). Однак було виявлено, що різноманітність транскриптому, індукована N. oblonga, була найнижчою серед чотирьох видів, на відміну від найвищої метабономічної різноманітності N. oblonga, раніше показаної у семи видів. Попередні дослідження показали, що набір генів, пов'язаних з ранніми захисними сигналами, включаючи сигнали JA, пояснює специфічність ранніх захисних реакцій, індукованих еліситорами, пов'язаними з травоїдними, у видів Nicotiana (39). Порівняння сигнальних шляхів JA між цими чотирма видами виявило цікаву закономірність (Рисунок 6B). Більшість генів цього шляху, такі як AOC, OPR3, ACX та COI1, показали відносно високий рівень індукції у цих чотирьох видів. Однак ключовий ген, JAR4, перетворює JA у його біологічно активну форму накопичених транскриптів JA-Ile, і рівень його транскрипції дуже низький, особливо у N. mills, Nepenthes pieris та N. microphylla. Крім того, у N. bifidum не було виявлено лише транскрипт іншого гена AOS. Ці зміни в експресії генів можуть бути відповідальними за екстремальні фенотипи, індуковані низькою продукцією JA у сигнально-анергічних видів та індукцією N. gracilis.
(A) Теорійно-інформаційний аналіз репрограмування ранніх транскрипційних відповідей чотирьох близькоспоріднених видів тютюну, відібраних через 30 хвилин після індукції травоїдною флорою. RDPI розраховується шляхом порівняння листя, індукованого травоїдною флорою, з контрольною групою з раною. Кольори вказують на різні види, а символи вказують на різні методи обробки. (B) Аналіз експресії генів у сигнальних шляхах JA серед чотирьох видів. Спрощений шлях JA показано поруч із коробковою діаграмою. Різні кольори вказують на різні методи обробки. Зірочка вказує на значну різницю між обробкою W + OS та контролем W + W (для t-критерію Стьюдента для попарних відмінностей, *P<0,05, **P<0,01 та ***P<0,001). OPDA, 12-оксофітодієнова кислота; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентеніл)-циклопентан-1-октанова кислота.
В останній частині ми досліджували, як видоспецифічне ремоделювання метаболому різних видів рослин у комах може бути стійким до травоїдних. Попередні дослідження зосереджувалися на роді Nicotiana. Їхня стійкість до Ms та личинок значно відрізняється (40). Тут ми вивчали зв'язок між цією моделлю та їхньою метаболічною пластичністю. Використовуючи вищезгадані чотири види тютюну та тестуючи кореляцію між різноманітністю та спеціалізацією метаболому, спричиненою травоїдними, та стійкістю рослин до Ms та Sl, ми виявили, що стійкість, різноманітність та спеціалізація до універсального Sl позитивно корелюють, тоді як кореляція між стійкістю до експертних дам та спеціалізацією є слабкою, а кореляція з різноманітністю є незначною (Рисунок S10). Що стосується стійкості до S1, то як ослаблені N. chinensis, так і N. gracilis, які раніше демонстрували як рівні передачі сигналу JA, так і пластичність метаболому, мали дуже різні реакції на індукцію травоїдними, а також вони демонстрували подібну високу стійкість. Стать.
За останні шістдесят років теорія захисту рослин забезпечила теоретичну основу, на основі якої дослідники передбачили значну кількість еволюції та функцій спеціалізованих метаболітів рослин. Більшість цих теорій не дотримуються звичайної процедури сильних висновків (41). Вони пропонують ключові прогнози (3) на одному рівні аналізу. Коли перевірка ключових прогнозів дозволяє проаналізувати конкретні теорії, це зробить галузь рухається вперед. Можна підтримувати, але відкидати інші (42). Натомість нова теорія робить прогнози на різних рівнях аналізу та додає новий шар описових міркувань (42). Однак дві теорії, запропоновані на функціональному рівні, МТ та ОД, можна легко пояснити як важливі прогнози спеціалізованих метаболічних змін, спричинених травоїдними: теорія ОД вважає, що зміни в спеціалізованому метаболічному «просторі» є дуже спрямованими. Теорія МТ вважає, що ці зміни будуть ненаправленими та випадково розташованими в метаболічному просторі, і, як правило, мають метаболіти з високою захисною цінністю. Попередні дослідження прогнозів ОД та МТ були перевірені з використанням вузького набору апріорних «захисних» сполук. Ці метаболітно-орієнтовані тести виключають можливість аналізу ступеня та траєкторії реконфігурації метаболому під час травоїдності та не дозволяють проводити тестування в рамках послідовної статистичної структури, що вимагатиме ключових прогнозів, які можна розглядати як єдине ціле. Кількісно оцінити зміни в метаболомі рослин. Тут ми використали інноваційну технологію в метаболоміці, засновану на обчислювальній мас-спектрометрії (MS), та провели деконволюційний мас-спектрометричний аналіз у загальній валюті дескрипторів теорії інформації, щоб перевірити різницю між ними, запропонованою на глобальному рівні метаболоміки. Ключовий прогноз цієї теорії. Теорія інформації застосовується в багатьох галузях, особливо в контексті досліджень біорізноманіття та потоку поживних речовин (43). Однак, наскільки нам відомо, це перше застосування, яке використовується для опису метаболічного інформаційного простору рослин та вирішення екологічних проблем, пов'язаних з тимчасовими метаболічними змінами у відповідь на сигнали навколишнього середовища. Зокрема, можливості цього методу полягають у його здатності порівнювати закономірності всередині та між видами рослин, щоб дослідити, як травоїдні еволюціонували від різних видів до міжвидових макроеволюційних закономірностей на різних рівнях еволюції. Метаболізм.
Аналіз головних компонентів (PCA) перетворює багатовимірний набір даних у простір зменшення розмірності, щоб можна було пояснити основну тенденцію даних, тому його зазвичай використовують як дослідницький метод для розбору набору даних, наприклад, деконволюційний метаболом. Однак зменшення розмірності призведе до втрати частини інформаційного вмісту в наборі даних, і PCA не може надати кількісну інформацію про характеристики, які є особливо актуальними для екологічної теорії, такі як: як травоїдні реконфігурують різноманітність у спеціалізованих галузях (наприклад, багатство, розподіл) та чисельність) метаболіти? Які метаболіти є предикторами індукованого стану даної травоїдної? З точки зору специфічності, різноманітності та індуцибельності, інформаційний вміст профілю листоспецифічних метаболітів розкладається, і виявляється, що вживання їжі травоїдними може активувати специфічний метаболізм. Несподівано ми помітили, що, як описано в індикаторах теорії інформації, результуюча метаболічна ситуація має значне перекриття після атак двох травоїдних (нічного універсала Sl) та експерта Solanaceae Ms. Хоча їхня харчова поведінка та концентрація суттєво відрізняються. Ініціатор кон'югату жирних кислот та амінокислот (FAC) в OS (31). Використовуючи OS травоїдних для лікування стандартизованих колотих ран, імітація лікування травоїдними також показала подібну тенденцію. Ця стандартизована процедура моделювання реакції рослин на атаки травоїдних усуває фактори, що впливають на організм, спричинені змінами в харчовій поведінці травоїдних, які призводять до різного ступеня пошкодження в різний час (34). FAC, який, як відомо, є основною причиною OSM, знижує реакції JAS та інших рослинних гормонів в OSS1, тоді як OSS1 знижує їх у сотні разів (31). Однак OSS1 викликав подібні рівні накопичення JA порівняно з OSM. Раніше було продемонстровано, що реакція JA в ослаблених Nepenthes дуже чутлива до OSM, де FAC може зберігати свою активність навіть у розведенні водою у співвідношенні 1:1000 (44). Тому, порівняно з OSM, хоча FAC в OSS1 дуже низький, його достатньо для індукції достатнього спалаху JA. Попередні дослідження показали, що порін-подібні білки (45) та олігосахариди (46) можуть бути використані як молекулярні ключі для запуску захисних реакцій рослин в OSS1. Однак досі незрозуміло, чи відповідають ці еліситори в OSS1 за накопичення JA, що спостерігається в поточному дослідженні.
Хоча існує небагато досліджень, що описують різні метаболічні відбитки, спричинені застосуванням різних травоїдних тварин або екзогенних JA чи SA (саліцилової кислоти) (47), ніхто не порушував видоспецифічні збурення травоїдної рослини в мережі рослин та його вплив на специфічну особисту інформацію. Загальний вплив метаболізму систематично вивчається. Цей аналіз додатково підтвердив, що зв'язок внутрішньої гормональної мережі з іншими рослинними гормонами, крім JA, формує специфічність метаболічної реорганізації, спричиненої травоїдними. Зокрема, ми виявили, що ET, спричинений OSM, був значно більшим, ніж спричинений OSS1. Цей режим узгоджується з більшим вмістом FAC в OSM, що є необхідною та достатньою умовою для запуску сплеску ET (48). У контексті взаємодії між рослинами та травоїдними тваринами сигнальна функція ET на динаміку метаболітів, специфічних для рослин, все ще є спорадичною та спрямована лише на одну групу сполук. Крім того, більшість досліджень використовували екзогенне застосування ET або його попередників чи різних інгібіторів для вивчення регуляції ET, серед яких ці екзогенні хімічні застосування призведуть до багатьох неспецифічних побічних ефектів. Наскільки нам відомо, це дослідження являє собою перше масштабне систематичне дослідження ролі ЕТ у використанні ЕТ для продукування та сприйняття порушених трансгенних рослин з метою координації динаміки метаболому рослин. Специфічна для травоїдних тварин індукція ЕТ може зрештою модулювати відповідь метаболому. Найбільш значущою є трансгенна маніпуляція генами біосинтезу (ACO) та сприйняття (ETR1), яка виявила специфічне для травоїдних тварин de novo накопичення феноламідів. Раніше було показано, що ЕТ може точно налаштовувати накопичення нікотину, індуковане JA, шляхом регулювання путресцин N-метилтрансферази (49). Однак з механічної точки зору незрозуміло, як ЕТ точно налаштовує індукцію фенаміду. На додаток до функції передачі сигналу ЕТ, метаболічний потік також може бути спрямований до S-аденозил-1-метіоніну для регулювання інвестування в поліамінофеноламіди. S-аденозил-1-метіонін є ЕТ та поширеним проміжним продуктом шляху біосинтезу поліамінів. Механізм, за допомогою якого сигнал ЕТ регулює рівень феноламіду, потребує подальшого вивчення.
Протягом тривалого часу, через велику кількість спеціальних метаболітів невідомої структури, пильна увага до конкретних метаболічних категорій не дозволяла чітко оцінити часові зміни метаболічного різноманіття після біологічних взаємодій. Наразі, на основі аналізу теорії інформації, основним результатом отримання спектру MS/MS на основі неупереджених метаболітів є те, що травоїдні, які їдять або імітують травоїдних, продовжують зменшувати загальне метаболічне різноманіття метаболому листя, одночасно збільшуючи ступінь його спеціалізації. Це тимчасове збільшення специфічності метаболому, спричинене травоїдними, пов'язане із синергетичним збільшенням специфічності транскриптому. Особливістю, яка найбільше сприяє цій більшій спеціалізації метаболому (що має вище значення Si), є спеціальний метаболіт з раніше охарактеризованою травоїдною функцією. Ця модель узгоджується з передбаченням теорії OD, але передбачення MT, пов'язане з випадковістю перепрограмування метаболому, не є узгодженим. Однак ці дані також узгоджуються з передбаченням змішаної моделі (найкраще MT; Рисунок 1B), оскільки інші неохарактеризовані метаболіти з невідомими захисними функціями все ще можуть слідувати випадковому розподілу Si.
Варто зазначити, що це дослідження також виявило, що від рівня мікроеволюції (окрема рослина та популяція тютюну) до більшого еволюційного масштабу (близькоспоріднені види тютюну) різні рівні еволюційної організації знаходяться в «найкращому захисті». Існують значні відмінності у здібностях травоїдних тварин. Мур та ін. (20) та Кесслер і Кальске (1) незалежно один від одного запропонували перетворити три функціональні рівні біорізноманіття, спочатку виділені Віттекером (50), на конститутивні та індуковані часові зміни хімічного різноманіття; ці автори також не підсумували процедури масштабного збору даних метаболому також не окреслюють, як розрахувати метаболічне різноманіття на основі цих даних. У цьому дослідженні незначні коригування функціональної класифікації Віттекера розглядатимуть α-метаболічне різноманіття як різноманітність спектрів MS/MS у даній рослині, а β-метаболічне різноманіття – як базовий внутрішньовидовий метаболізм групи популяцій, а γ-метаболічне різноманіття буде розширенням аналізу подібних видів.
Сигнал JA є важливим для широкого спектру метаболічних реакцій травоїдних. Однак бракує ретельного кількісного тестування внеску внутрішньовидової регуляції біосинтезу JA у різноманітність метаболому, і чи є сигнал JA загальним місцем для стрес-індукованої метаболічної диверсифікації на вищому макроеволюційному масштабі, досі невідомо. Ми спостерігали, що травоїдна природа рослиноїдних Nepenthes індукує спеціалізацію метаболому, а варіація спеціалізації метаболому в межах популяції видів Nicotiana та серед близькоспоріднених видів Nicotiana систематично позитивно корелює з сигналізацією JA. Крім того, коли сигнал JA порушений, метаболічна специфічність, індукована травоїдною твариною одного генотипу, буде скасована (Рисунок 3, C та E). Оскільки зміни метаболічного спектру природно ослаблених популяцій Nepenthes є здебільшого кількісними, зміни в метаболічному β-різноманітті та специфічності в цьому аналізі можуть бути значною мірою спричинені сильним збудженням багатих на метаболіти категорій сполук. Ці класи сполук домінують у частині профілю метаболому та призводять до позитивної кореляції з сигналами JA.
Оскільки біохімічні механізми видів тютюну, близькоспоріднених з ним, дуже відрізняються, метаболіти специфічно ідентифікуються в якісному аспекті, тому він є більш аналітичним. Обробка отриманого метаболічного профілю за допомогою теорії інформації показує, що індукція травоїдних посилює компроміс між метаболічною гамма-різноманітністю та спеціалізацією. Сигнал JA відіграє центральну роль у цьому компромісі. Збільшення спеціалізації метаболому узгоджується з основним прогнозом оптичної щільності (OD) і позитивно корелює з сигналом JA, тоді як сигнал JA негативно корелює з метаболічною гамма-різноманітністю. Ці моделі вказують на те, що здатність OD рослин головним чином визначається пластичністю JA, як у мікроеволюційному масштабі, так і в більшому еволюційному масштабі. Екзогенні експерименти із застосуванням JA, які обходять дефекти біосинтезу JA, додатково показують, що близькоспоріднені види тютюну можна розрізнити на сигнально-чутливі та сигнально-нечутливі види, так само як і їхній спосіб JA та пластичність метаболому, індукована травоїдними. Види, що не реагують на сигнали, не можуть реагувати через свою нездатність виробляти ендогенну JA і тому підлягають фізіологічним обмеженням. Це може бути спричинено мутаціями в деяких ключових генах сигнального шляху JA (AOS та JAR4 у N. crescens). Цей результат підкреслює, що ці міжвидові макроеволюційні патерни можуть бути головним чином зумовлені змінами у внутрішньому сприйнятті та реакції на гормони.
Окрім взаємодії між рослинами та травоїдними тваринами, дослідження метаболічного різноманіття пов'язане з усіма важливими теоретичними досягненнями в дослідженні біологічної адаптації до навколишнього середовища та еволюції складних фенотипових ознак. Зі збільшенням обсягу даних, отриманих за допомогою сучасних інструментів мас-спектрометрії (MS), перевірка гіпотез щодо метаболічної різноманітності тепер може вийти за межі індивідуальних/категорійних відмінностей у метаболітах та виконати глобальний аналіз, щоб виявити неочікувані закономірності. У процесі великомасштабного аналізу важливою метафорою є ідея створення змістовних карт, які можна використовувати для дослідження даних. Тому важливим результатом поточного поєднання неупередженої метаболоміки MS/MS та теорії інформації є те, що вона забезпечує просту метрику, яку можна використовувати для побудови карт для перегляду метаболічного різноманіття в різних таксономічних масштабах. Це основна вимога цього методу. Вивчення мікро/макро еволюції та екології спільнот.
На макроеволюційному рівні, основою теорії коеволюції рослин і комах Ерліха та Равена (51) є передбачення, що варіація міжвидового метаболічного різноманіття є причиною диверсифікації рослинних ліній. Однак, за п'ятдесят років після публікації цієї основоположної роботи, ця гіпотеза рідко перевірялася (52). Це значною мірою пов'язано з філогенетичними характеристиками порівнянних метаболічних характеристик у різних рослинних лініях на великі відстані. Цю рідкість можна використовувати для закріплення методів аналізу цілей. Поточний робочий процес MS/MS, оброблений теорією інформації, кількісно визначає структурну подібність MS/MS невідомих метаболітів (без попереднього відбору метаболітів) і перетворює ці MS/MS на набір MS/MS, таким чином, у професійному метаболізмі. Ці макроеволюційні моделі порівнюються за шкалою класифікації. Прості статистичні показники. Процес подібний до філогенетичного аналізу, який може використовувати вирівнювання послідовностей для кількісної оцінки швидкості диверсифікації або еволюції ознак без попереднього прогнозування.
На біохімічному рівні гіпотеза скринінгу Фірна та Джонса (53) показує, що метаболічне різноманіття підтримується на різних рівнях, щоб забезпечити сировину для прояву біологічної активності раніше не пов'язаних або заміщених метаболітів. Методи теорії інформації забезпечують основу, в якій ці метаболітно-специфічні еволюційні переходи, що відбуваються під час спеціалізації метаболітів, можна кількісно визначити як частину запропонованого еволюційного процесу скринінгу: біологічно активна адаптація від низької специфічності до високої специфічності. Інгібовані метаболіти даного середовища.
Загалом, на зорі розвитку молекулярної біології були розроблені важливі теорії захисту рослин, а дедуктивні методи, засновані на гіпотезах, широко вважаються єдиним засобом наукового прогресу. Це значною мірою пов'язано з технічними обмеженнями вимірювання всього метаболому. Хоча методи, засновані на гіпотезах, особливо корисні для вибору інших причинно-наслідкових механізмів, їхня здатність поглибити наше розуміння біохімічних мереж є більш обмеженою, ніж обчислювальні методи, доступні наразі в сучасній науці, що використовує багато даних. Тому теорії, які неможливо передбачити, далеко виходять за рамки доступних даних, тому гіпотетичний цикл формул/тестування прогресу в дослідницькій галузі не можна скасувати (4). Ми передбачаємо, що обчислювальний робочий процес метаболоміки, представлений тут, може відродити інтерес до нещодавніх (як) та остаточних (чому) питань метаболічного різноманіття та сприяти новій ері теоретично орієнтованої науки про дані. Ця епоха переглянула важливі теорії, які надихали попередні покоління.
Пряме годування травоїдними тваринами здійснюється шляхом вирощування личинки другого віку або личинки Sl на одному блідо-забарвленому листку однієї квітучої рослини троянди, з 10 рослинними повторностями на рослину. Личинок комах затискали затискачами, а решту тканини листка збирали через 24 та 72 години після зараження та швидко заморожували, а метаболіти екстрагували.
Імітуйте обробку травоїдними рослинами високосинхронізованим способом. Метод полягає у використанні колес із тканинним візерунком для проколювання трьох рядів шипів з кожного боку середньої жилки трьох повністю розкритих листків рослини на стадії росту тканинної гірлянди та негайному нанесенні розведеного 1:5 розчину Ms. Або використовуйте рукавички для введення S1 OS у рану від проколу. Зберіть та обробіть листок, як описано вище. Використовуйте раніше описаний метод для екстракції первинних метаболітів та рослинних гормонів (54).
Для екзогенного застосування JA три черешкові листки кожної з шести квітучих рослин троянд кожного виду обробляють 20 мкл ланолінової пасти, що містить 150 мкг MeJA (Lan + MeJA), та 20 мкл ланоліну з обробкою ран (Lan + W), або використовують 20 мкл чистого ланоліну як контроль. Листя збирають через 72 години після обробки, заморожують у рідкому азоті та зберігають при температурі -80°C до використання.
У нашій дослідницькій групі було ідентифіковано чотири трансгенні лінії JA та ET, а саме irAOC (36), irCOI1 (55), irACO та sETR1 (48). irAOC демонструвала значне зниження рівнів JA та JA-Ile, тоді як irCOI1 не була чутливою до JA. Порівняно з EV, накопичення JA-Ile збільшилося. Аналогічно, irACO зменшує продукцію ET, а порівняно з EV, sETR1, який нечутливий до ET, збільшує продукцію ET.
Для неінвазивного вимірювання ЕТ використовується фотоакустичний лазерний спектрометр (датчик ЕТ ​​реального часу Sensor Sense ETD-300). Відразу після обробки половину листя зрізали та перенесли в герметичний скляний флакон об'ємом 4 мл, а рідині над рідиною дали накопичитися протягом 5 годин. Під час вимірювання кожен флакон промивали потоком чистого повітря зі швидкістю 2 літри/годину протягом 8 хвилин, яке попередньо пройшло через каталізатор, наданий Sensor Sense, для видалення CO2 та води.
Дані мікрочипів були вперше опубліковані в (35) та збережені в Комплексній базі даних експресії генів Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) (номер доступу GSE30287). Для цього дослідження були вилучені дані, що відповідають листям, спричиненим обробкою W + OSM, та неушкодженому контролю. Необроблена інтенсивність становить log2. Перед статистичним аналізом базову лінію було перетворено та нормалізовано до 75-го процентиля за допомогою програмного пакету R.
Оригінальні дані секвенування РНК (RNA-seq) видів Nicotiana були отримані з архіву коротких зчитувань NCBI (SRA), номер проекту PRJNA301787, про який повідомляли Zhou та ін. (39), та продовжені, як описано в (56). Необроблені дані, оброблені W + W, W + OSM та W + OSS1, що відповідають видам Nicotiana, були відібрані для аналізу в цьому дослідженні та оброблені наступним чином: Спочатку необроблені показники RNA-seq були перетворені у формат FASTQ. HISAT2 перетворює FASTQ в SAM, а SAMtools перетворює файли SAM у відсортовані файли BAM. StringTie використовується для розрахунку експресії генів, а його метод експресії полягає в тому, що є фрагменти на тисячу основ фрагментів на мільйон секвенованих фрагментів транскрипції.
Хроматографічна колонка Acclaim (150 мм x 2,1 мм; розмір частинок 2,2 мкм), що використовувалася в аналізі, та захисна колонка 4 мм x 4 мм виготовлені з того самого матеріалу. У системі надвисокоефективної рідинної хроматографії (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 використовується наступний бінарний градієнт: від 0 до 0,5 хвилини, ізократичний 90% A [деіонізована вода, 0,1% (об./об.) ацетонітрилу та 0,05% мурашиної кислоти], 10% B (ацетонітрил та 0,05% мурашиної кислоти); від 0,5 до 23,5 хвилини, градієнтна фаза становить 10% A та 90% B відповідно; від 23,5 до 25 хвилин, ізократичний 10% A та 90% B. Швидкість потоку становить 400 мкл/хв. Для всіх аналізів мас-спектрометрією (МС) введіть елюент колонки в квадрупольний аналізатор з часом прольоту (qTOF), оснащений джерелом електророзпилення, що працює в режимі позитивної іонізації (напруга на капілярі 4500 В; вихід капіляра 130 В; температура сушіння 200°C; потік повітря під час сушіння 10 літрів/хв).
Виконайте аналіз фрагментів MS/MS (далі – MS/MS), які є нерелевантними або не відрізняються від даних, щоб отримати структурну інформацію про загальний виявляний метаболічний профіль. Концепція нерозбірливого методу MS/MS базується на тому факті, що квадруполь має дуже велике вікно ізоляції маси [тому всі сигнали співвідношення маси до заряду (m/z) слід розглядати як фрагменти]. З цієї причини, оскільки прилад Impact II не зміг створити нахил CE, було проведено кілька незалежних аналізів з використанням збільшених значень енергії дисоціації зіткнень (CE), індукованої зіткненням. Коротше кажучи, спочатку проаналізуйте зразок за допомогою UHPLC-електроспрейної іонізації/qTOF-MS, використовуючи режим одиночної мас-спектрометрії (умови низької фрагментації, що генеруються фрагментацією в джерелі), скануючи від m/z 50 до 1500 з частотою повторення 5 Гц. Використовуйте азот як газ зіткнень для аналізу MS/MS та виконайте незалежні вимірювання при наступних чотирьох різних напругах дисоціації, індукованої зіткненнями: 20, 30, 40 та 50 еВ. Протягом усього процесу вимірювання квадруполь має найбільше вікно ізоляції маси, від m/z 50 до 1500. Коли експеримент з m/z переднього тіла та шириною ізоляції встановлено на 200, діапазон мас автоматично активується операційним програмним забезпеченням приладу та 0 Да. Скануйте на наявність фрагментів маси, як у режимі однієї маси. Використовуйте форміат натрію (50 мл ізопропанолу, 200 мкл мурашиної кислоти та 1 мл 1M водного розчину NaOH) для калібрування маси. Використовуючи високоточний алгоритм калібрування Bruker, файл даних калібрується після запуску усереднення спектру за заданий період часу. Використовуйте функцію експорту програмного забезпечення Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Бремен, Німеччина) для перетворення файлів необроблених даних у формат NetCDF. Набір даних MS/MS було збережено у відкритій базі даних метаболоміки MetaboLights (www.ebi.ac.uk) з номером доступу MTBLS1471.
Збірку MS/MS можна реалізувати за допомогою кореляційного аналізу між сигналами якості MS1 та MS/MS для низької та високої енергії зіткнення та нещодавно впроваджених правил. Для реалізації кореляційного аналізу розподілу прекурсора до продукту використовується скрипт R, а для реалізації правил – скрипт C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Щоб зменшити помилки хибнопозитивних результатів, спричинені фоновим шумом та хибною кореляцією, що виникає внаслідок виявлення певних m/z-ознак лише в кількох зразках, ми використовуємо функцію «заповнений пік» пакета R XCMS (для корекції фонового шуму). Вона повинна використовуватися для заміни інтенсивності «NA» (невиявлений пік). Коли використовується функція заповненого піку, у наборі даних все ще залишається багато значень інтенсивності «0», які впливатимуть на розрахунок кореляції. Потім ми порівнюємо результати обробки даних, отримані з використанням функції заповненого піку та без використання функції заповненого піку, та обчислюємо значення фонового шуму на основі середнього скоригованого оціненого значення, а потім замінюємо ці 0-значення інтенсивності обчисленим фоновим значенням. Ми також розглядали лише ознаки, інтенсивність яких утричі перевищувала фонове значення, і вважали їх «істинними піками». Для розрахунків PCC розглядаються лише m/z-сигнали наборів даних попередника зразка (MS1) та фрагмента з щонайменше вісьмома істинними піками.
Якщо інтенсивність ознаки якості прекурсора у всьому зразку суттєво корелює зі зниженою інтенсивністю тієї ж ознаки якості, яка піддається низькій або високій енергії зіткнення, і ця ознака не позначена як ізотопний пік за допомогою CAMERA, її можна додатково визначити. Потім, шляхом обчислення всіх можливих пар прекурсор-продукт протягом 3 секунд (орієнтовне вікно часу утримання для утримання піку), виконується кореляційний аналіз. Тільки коли значення m/z нижче за значення прекурсора, і фрагментація MS/MS відбувається в тому ж місці зразка в наборі даних, що й прекурсор, з якого він походить, його вважають фрагментом.
Виходячи з цих двох простих правил, ми виключаємо зазначені фрагменти зі значеннями m/z, більшими за m/z ідентифікованого попередника, та виходячи з позиції зразка, де з'являється попередник, та зазначеного фрагмента. Також можливо вибрати ознаки якості, згенеровані багатьма фрагментами у вихідному коді, згенерованими в режимі MS1, як кандидати-попередники, тим самим генеруючи надлишкові сполуки MS/MS. Щоб зменшити цю надмірність даних, якщо подібність NDP спектрів перевищує 0,6, і вони належать до хроматограми «pcgroup», анотованої CAMERA, ми об'єднаємо їх. Нарешті, ми об'єднаємо всі чотири результати CE, пов'язані з попередником та фрагментами, у кінцевий деконволютований композитний спектр, вибравши пік найвищої інтенсивності серед усіх кандидатних піків з однаковим значенням m/z при різних енергіях зіткнення. Наступні кроки обробки базуються на концепції композитного спектру та враховують різні умови CE, необхідні для максимізації ймовірності фрагментації, оскільки деякі фрагменти можна виявити лише при певній енергії зіткнення.
Для розрахунку індуцибельності метаболічного профілю було використано RDPI (30). Різноманітність метаболічного спектру (індекс Hj) виводиться з кількості попередників MS/MS за допомогою ентропії Шеннона розподілу частот MS/MS, використовуючи наступне рівняння, описане Мартінесом та ін. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), де Pij відповідає відносній частоті i-ї MS/MS у j-й вибірці (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m)t).
Метаболічна специфічність (індекс Si) визначається як ідентичність експресії даної MS/MS відносно частоти між розглянутими зразками. Специфічність MS/MS розраховується як Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Використовуйте наступну формулу для вимірювання специфічного для метаболому індексу δj кожного j-го зразка та середнього значення специфічності MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Спектри MS/MS вирівнюються попарно, і подібність розраховується на основі двох оцінок. Спочатку, використовуючи стандартний метод NDP (також відомий як метод косинусної кореляції), використовуйте наступне рівняння для оцінки подібності сегментів між спектрами NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, де S1 та S2 Відповідно, для спектру 1 та спектру 2, а також WS1, i та WS2, i представляє вагу на основі інтенсивності піку, що різниця i-го спільного піку між двома спектрами менше 0,01 Да. Вага розраховується наступним чином: W = [інтенсивність піку] m [якість] n, m = 0,5, n = 2, як запропоновано MassBank.
Було реалізовано другий метод оцінювання, який включав аналіз спільної NL між MS/MS. Для цього ми використовували 52 списки NL, які часто зустрічаються під час процесу фрагментації MS, одночасно, та більш специфічну NL (файл даних S1), яка була раніше анотована для спектру MS/MS вторинних метаболітів ослабленого виду Nepenthes (9, 26). Створіть бінарний вектор 1 та 0 для кожної MS/MS, що відповідає поточній та відсутній деякій NL відповідно. На основі подібності евклідової відстані розраховується оцінка подібності NL для кожної пари бінарних NL-векторів.
Для виконання подвійної кластеризації ми використовували пакет R DiffCoEx, який базується на розширенні зваженого аналізу коекспресії генів (WGCNA). Використовуючи матриці оцінювання NDP та NL спектрів MS/MS, ми використовували DiffCoEx для розрахунку матриці порівняльної кореляції. Бінарна кластеризація виконується шляхом встановлення параметра «cutreeDynamic» на method = «hybrid», cutHeight = 0.9999, deepSplit = T та minClusterSize = 10. Вихідний код R DiffCoEx був завантажений з додаткового файлу 1 Тессоном та ін. (57); необхідний пакет програмного забезпечення R WGCNA можна знайти за адресою https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Для проведення молекулярного мережевого аналізу MS/MS ми розрахували парну спектральну зв'язність на основі типів подібності NDP та NL, а також використали програмне забезпечення Cytoscape для візуалізації топології мережі за допомогою органічного розміщення в розширенні алгоритму розміщення CyFilescape yFiles.
Для проведення статистичного аналізу даних використовуйте R версії 3.0.1. Статистичну значущість оцінювали за допомогою двофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA), а потім застосовували постфактумний тест на чесну значущість різниці (HSD) за Тьюкі. Для аналізу різниці між групою рослиноїдних тварин та контролем двосторонній розподіл двох груп зразків з однаковою дисперсією аналізували за допомогою t-критерію Стьюдента.
Додаткові матеріали до цієї статті див. за посиланням http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Це стаття з відкритим доступом, що розповсюджується відповідно до умов ліцензії Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, яка дозволяє використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії, за умови, що кінцеве використання не має комерційної вигоди, і передумова полягає в тому, що оригінальна робота є правильною. Посилання.
Примітка: Ми просимо вас надати свою адресу електронної пошти лише для того, щоб людина, яку ви рекомендуєте для сторінки, знала, що ви хочете, щоб вона побачила цей лист, і що це не спам. Ми не збиратимемо жодних адрес електронної пошти.
Це питання використовується для перевірки, чи ви відвідувач, та запобігання автоматичному надсиланню спаму.
Теорія інформації забезпечує універсальну валюту для порівняння спеціальних метаболомів та прогнозування теорій тестового захисту.
Теорія інформації забезпечує універсальну валюту для порівняння спеціальних метаболомів та прогнозування теорій тестового захисту.
©2021 Американська асоціація сприяння розвитку науки. всі права захищені. AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.