Раніше ми повідомляли, що рівні в сироватці крові метаболіту триптофану, індол-3-пропіонової кислоти (IPA), що походить з кишечника, нижчі у пацієнтів з фіброзом печінки. У цьому дослідженні ми досліджували транскриптом та ДНК-метилом у печінці з ожирінням у зв'язку з рівнями IPA у сироватці крові, а також роль IPA в індукції фенотипової інактивації зірчастих клітин печінки (HSCs) in vitro.
У дослідженні взяли участь 116 пацієнтів з ожирінням без цукрового діабету 2 типу (ЦД2) (вік 46,8 ± 9,3 років; ІМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м²), яким було проведено баріатричну операцію в Центрі баріатричної хірургії Куопіо (KOBS). Рівні циркулюючого IPA вимірювали за допомогою рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (LC-MS), аналіз транскриптома печінки проводили за допомогою секвенування тотальної РНК, а аналіз метилювання ДНК проводили за допомогою Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Для експериментів in vitro використовували зірчасті клітини печінки людини (LX-2).
Рівні IPA у сироватці крові корелювали з експресією генів, задіяних в апоптотичних, мітофагічних та довголіття шляхах у печінці. Ген AKT серин/треонінкінази 1 (AKT1) був найпоширенішим та домінантним взаємодіючим геном у профілях транскриптів печінки та метилювання ДНК. Обробка IPA індукувала апоптоз, зменшувала мітохондріальне дихання та змінювала морфологію клітин і динаміку мітохондрій, модулюючи експресію генів, які, як відомо, регулюють фіброз, апоптоз і виживання клітин LX-2.
Узяті разом, ці дані підтверджують, що IPA має потенційні терапевтичні ефекти та може індукувати апоптоз і зміщувати фенотип HSC у неактивний стан, тим самим розширюючи можливість пригнічення фіброзу печінки шляхом впливу на активацію HSC та мітохондріальний метаболізм.
Поширеність ожиріння та метаболічного синдрому пов'язана зі зростанням частоти виникнення метаболічно асоційованої жирової хвороби печінки (MASLD); це захворювання вражає від 25% до 30% населення загалом [1]. Основним наслідком етіології MASLD є фіброз печінки, динамічний процес, що характеризується безперервним накопиченням фіброзного позаклітинного матриксу (ECM) [2]. Основними клітинами, що беруть участь у фіброзі печінки, є печінкові зірчасті клітини (HSCs), які демонструють чотири відомі фенотипи: спокійні, активовані, інактивовані та старіючі [3, 4]. HSCs можуть активуватися та трансдиференціюватися зі спокійної форми в проліферативні фібробластоподібні клітини з високими енергетичними потребами, зі збільшеною експресією α-актину гладких м'язів (α-SMA) та колагену I типу (Col-I) [5, 6]. Під час зворотного розвитку фіброзу печінки активовані HSCs елімінуються шляхом апоптозу або інактивації. Ці процеси включають зниження регуляції фіброгенних генів та модуляцію генів, що сприяють виживанню (таких як сигнальні шляхи NF-κB та PI3K/Akt) [7, 8], а також зміни в динаміці та функції мітохондрій [9].
Було виявлено, що рівень метаболіту триптофану індол-3-пропіонової кислоти (IPA), що виробляється в кишечнику, у сироватці крові знижений при метаболічних захворюваннях людини, включаючи MASLD [10–13]. IPA пов'язаний зі споживанням харчових волокон, відомий своїми антиоксидантними та протизапальними властивостями, а також послаблює фенотип неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ), індукованого дієтою, in vivo та in vitro [11–14]. Деякі докази отримані з нашого попереднього дослідження, яке продемонструвало, що рівень IPA у сироватці крові був нижчим у пацієнтів з фіброзом печінки, ніж у пацієнтів з ожирінням без фіброзу печінки в дослідженні баріатричної хірургії Куопіо (KOBS). Крім того, ми показали, що лікування IPA може зменшити експресію генів, які є класичними маркерами клітинної адгезії, міграції клітин та активації гемопоетичних стовбурових клітин у моделі зірчастих клітин печінки людини (LX-2), і є потенційним гепатопротекторним метаболітом [15]. Однак залишається незрозумілим, як IPA індукує регресію фіброзу печінки, активуючи апоптоз HSC та мітохондріальну біоенергетику.
Тут ми демонструємо, що сироватковий IPA пов'язаний з експресією генів, збагачених шляхами апоптозу, мітофагії та довголіття, у печінці осіб з ожирінням, але без діабету 2 типу (KOBS). Крім того, ми виявили, що IPA може індукувати кліренс та деградацію активованих гемопоетичних стовбурових клітин (HSCs) через шлях інактивації. Ці результати розкривають нову роль IPA, що робить його потенційною терапевтичною мішенню для сприяння регресії фіброзу печінки.
Попереднє дослідження в когорті KOBS показало, що у пацієнтів з фіброзом печінки рівні IPA у крові були нижчі порівняно з пацієнтами без фіброзу печінки [15]. Щоб виключити потенційний вплив діабету 2 типу, ми набрали 116 пацієнтів з ожирінням без діабету 2 типу (середній вік ± стандартне відхилення: 46,8 ± 9,3 років; ІМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (Таблиця 1) з поточного дослідження KOBS як досліджувану популяцію [16]. Усі учасники надали письмову інформовану згоду, а протокол дослідження був схвалений Етичним комітетом лікарні округу Північне Саво відповідно до Гельсінської декларації (54/2005, 104/2008 та 27/2010).
Зразки біопсії печінки були отримані під час баріатричної хірургії та гістологічно оцінені досвідченими патологоанатомами відповідно до раніше описаних критеріїв [17, 18]. Критерії оцінки наведено в Додатковій таблиці S1 та були описані раніше [19].
Зразки сироватки крові натщесерце аналізували за допомогою нецільової рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (LC-MS) для метаболомного аналізу (n = 116). Зразки аналізували за допомогою системи UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Вальдбронн, Карлсруе, Німеччина), як описано раніше19. Ідентифікація ізопропілового спирту (IPA) базувалася на часі утримування та порівнянні спектру MS/MS з чистими стандартами. Інтенсивність сигналу IPA (площа піку) враховували у всіх подальших аналізах [20].
Секвенування РНК цілої печінки проводили за допомогою Illumina HiSeq 2500, а дані попередньо обробляли, як описано раніше [19, 21, 22]. Ми провели цільовий диференціальний аналіз експресії транскриптів, що впливають на функцію/біогенез мітохондрій, використовуючи 1957 генів, вибраних з бази даних MitoMiner 4.0 [23]. Аналіз метилювання ДНК печінки проводили за допомогою Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) з використанням тієї ж методології, що описана раніше [24, 25].
Зірчасті клітини печінки людини (LX-2) були люб'язно надані професором Стефано Ромео та культивовані й підтримувані в середовищі DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Для вибору робочої дози IPA клітини LX-2 обробляли різними концентраціями IPA (10 мкМ, 100 мкМ та 1 мМ; Sigma, 220027) у середовищі DMEM/F12 протягом 24 годин. Крім того, для дослідження здатності IPA інактивувати HSCs, клітини LX-2 спільно обробляли 5 нг/мл TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) та 1 мМ IPA у безсироватковому середовищі протягом 24 годин. Для відповідних контрольних розчинів для обробки TGF-β1 використовували 4 нМ HCl, що містить 0,1% BSA, та 0,05% DMSO для обробки IPA, і обидва використовували разом для комбінованого лікування.
Апоптоз оцінювали за допомогою набору FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit з 7-AAD (Biolegend, Сан-Дієго, Каліфорнія, США, кат. № 640922) згідно з інструкціями виробника. Коротко, LX-2 (1 × 105 клітин/лунка) культивували протягом ночі в 12-лункових планшетах, а потім обробляли кількома дозами IPA або IPA та TGF-β1. Наступного дня плаваючі та прикріплені клітини збирали, трипсинізували, промивали PBS, ресуспендували в буфері для зв'язування з Анексином V та інкубували з FITC-Annexin V та 7-AAD протягом 15 хвилин.
Мітохондрії в живих клітинах фарбували на окислювальну активність за допомогою Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Каліфорнія). Для MTR-аналізів клітини LX-2 інкубували при однаковій щільності з IPA та TGF-β1. Через 24 години живі клітини трипсинізували, промивали PBS, а потім інкубували зі 100 мкМ MTR у безсироватковому середовищі при 37 °C протягом 20 хвилин, як описано раніше [26]. Для аналізу морфології живих клітин розмір клітин та їхню цитоплазматичну складність аналізували за допомогою параметрів прямого розсіювання (FSC) та бічного розсіювання (SSC) відповідно.
Всі дані (30 000 подій) були отримані за допомогою NovoCyte Quanteon (Agilent) та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення NovoExpress® 1.4.1 або FlowJo V.10.
Швидкість споживання кисню (OCR) та швидкість позаклітинного підкислення (ECAR) вимірювали в режимі реального часу за допомогою аналізатора позаклітинного потоку Seahorse (Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія), оснащеного Seahorse XF Cell Mito Stress, згідно з інструкціями виробника. Коротко кажучи, 2 × 104 клітин LX-2/лунка висівали на планшети для культури клітин XF96. Після нічної інкубації клітини обробляли ізопропанолом (IPA) та TGF-β1 (Додаткові методи 1). Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення Seahorse XF Wave, яке включає генератор звітів про фенотип клітинної енергії Seahorse XF. На основі цього розраховували індекс біоенергетичного здоров'я (BHI) [27].
Загальну РНК транскрибували в кДНК. Щодо конкретних методів, див. посилання [15]. Рівні мРНК людського 60S рибосомного кислого білка P0 (RPLP0) та циклофіліну A1 (PPIA) використовували як конститутивний контроль генів. Використовували систему ПЛР у реальному часі QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Ландсмер, Нідерланди) з набором TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) або набором Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), а відносну кратність експресії генів розраховували за допомогою порівняльних параметрів циклу значень Ct (ΔΔCt) та методу ∆∆Ct. Детальна інформація про праймери наведена в додаткових таблицях S2 та S3.
Ядерну ДНК (нкДНК) та мітохондріальну ДНК (мтДНК) екстрагували за допомогою набору DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), як описано раніше [28]. Відносну кількість мтДНК розраховували шляхом обчислення співвідношення кожної цільової області мтДНК до середнього геометричного значення трьох областей ядерної ДНК (мтДНК/нкДНК), як детально описано в Додаткових методах 2. Детальна інформація про праймери для мтДНК та нкДНК наведена в Додатковій таблиці S4.
Живі клітини фарбували за допомогою Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Каліфорнія) для візуалізації міжклітинних та внутрішньоклітинних мітохондріальних мереж. Клітини LX-2 (1 × 10⁴ клітин/лунка) культивували на скляних слайдах у відповідних чашках для культури зі скляним дном (Ibidi GmbH, Мартінсрід, Німеччина). Через 24 години живі клітини LX-2 інкубували зі 100 мкМ MTR протягом 20 хвилин при 37 °C, а ядра клітин фарбували DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich), як описано раніше [29]. Мітохондріальні мережі візуалізували за допомогою інвертованого мікроскопа Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Єна, Німеччина), оснащеного конфокальним модулем Zeiss LSM 800, при 37 °C у зволоженій атмосфері з 5% CO₂, використовуючи об'єктив 63×NA 1.3. Ми отримали десять зображень Z-серії для кожного типу зразка. Кожна Z-серія містить 30 зрізів, кожен товщиною 9,86 мкм. Для кожного зразка зображення десяти різних полів зору були отримані за допомогою програмного забезпечення ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Єна, Німеччина), а аналіз морфології мітохондрій був проведений за допомогою програмного забезпечення ImageJ (версія 1.54d) [30, 31] відповідно до параметрів, детально описаних у Додаткових методах 3.
Клітини фіксували 2% глутаральдегідом у 0,1 М фосфатному буфері, потім фіксували 1% розчином чотириокису осмію (Sigma Aldrich, Міссурі, США), поступово зневоднювали ацетоном (Merck, Дармштадт, Німеччина) і, нарешті, заливали епоксидною смолою. Ультратонкі зрізи готували та забарвлювали 1% уранілацетатом (Merck, Дармштадт, Німеччина) та 1% цитратом свинцю (Merck, Дармштадт, Німеччина). Ультраструктурні зображення отримували за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токіо, Японія) при прискорювальній напрузі 80 кВ.
Морфологію клітин LX-2, оброблених IPA протягом 24 годин, аналізували за допомогою фазово-контрастної мікроскопії при 50-кратному збільшенні з використанням інвертованого світлового мікроскопа Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 та AxioCam MRm, Єна, Німеччина).
Клінічні дані були виражені як середнє значення ± стандартне відхилення або медіана (міжквартильний діапазон: IQR). Для порівняння відмінностей між трьома досліджуваними групами використовували однофакторний дисперсійний аналіз (безперервні змінні) або χ²-тест (категоріальні змінні). Для корекції множинного тестування використовували рівень хибнопозитивних результатів (FDR), а гени з FDR < 0,05 вважали статистично значущими. Для кореляції метилювання CpG ДНК з інтенсивністю сигналу IPA використовували кореляційний аналіз Спірмена, при цьому повідомляли про номінальні значення p (p < 0,05).
Аналіз шляхів було проведено за допомогою веб-інструменту аналізу наборів генів (WebGestalt) для 268 транскриптів (номінальне p < 0,01), 119 транскриптів, пов'язаних з мітохондріями (номінальне p < 0,05) та 4350 CpG з 3093 транскриптів печінки, які були пов'язані з рівнями IPA у сироватці крові. Для пошуку генів, що перекриваються, було використано вільнодоступний інструмент Venny DB (версія 2.1.0), а для візуалізації білок-білкових взаємодій – StringDB (версія 11.5).
Для експерименту LX-2 зразки були перевірені на нормальність за допомогою тесту Д'Агостіно-Пірсона. Дані були отримані щонайменше з трьох біологічних повторностей та піддані однофакторному дисперсійному аналізу (ANOVA) з post hoc тестом Бонферроні. Значення p менше 0,05 вважалося статистично значущим. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD), а кількість експериментів вказана на кожному рисунку. Всі аналізи та графіки були виконані за допомогою статистичного програмного забезпечення GraphPad Prism 8 для Windows (GraphPad Software Inc., версія 8.4.3, Сан-Дієго, США).
Спочатку ми дослідили зв'язок рівнів IPA у сироватці крові з транскриптами печінки, всього тіла та мітохондрій. У загальному профілі транскриптів найсильніше пов'язаним з рівнями IPA у сироватці крові був MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; протеїнкіназа 3, активована мітогеном); у профілі транскриптів, пов'язаних з мітохондріями, найсильніше пов'язаним був ген AKT1 (FDR = 0,7621; AKT серин/треонін кіназа 1) (Додатковий файл 1 та Додатковий файл 2).
Потім ми проаналізували глобальні транскрипти (n = 268; p < 0,01) та транскрипти, пов'язані з мітохондріями (n = 119; p < 0,05), зрештою визначивши апоптоз як найважливіший канонічний шлях (p = 0,0089). Щодо мітохондріальних транскриптів, пов'язаних з рівнями IPA у сироватці крові, ми зосередилися на апоптозі (FDR = 0,00001), мітофагії (FDR = 0,00029) та сигнальних шляхах TNF (FDR = 0,000006) (Рисунок 1A, Таблиця 2 та Додаткові Рисунки 1A-B).
Аналіз перекриття глобальних, мітохондріально-асоційованих транскриптів та метилювання ДНК у печінці людини у зв'язку з рівнями IPA у сироватці крові. A представляє 268 глобальних транскриптів, 119 мітохондріально-асоційованих транскриптів та метильованих ДНК транскриптів, які картовані на 3092 CpG-сайти, пов'язані з рівнями IPA у сироватці крові (значення p < 0,01 для глобальних транскриптів та метильованої ДНК, а значення p < 0,05 для мітохондріальних транскриптів). Основні перекриваючі транскрипти показані посередині (AKT1 та YKT6). B Карта взаємодії 13 генів з найвищим балом взаємодії (0,900) з іншими генами була побудована з 56 перекриваючихся генів (область чорної лінії), які були значно пов'язані з рівнями IPA у сироватці крові за допомогою онлайн-інструменту StringDB. Зелений: Гени, картовані на клітинний компонент Gene Ontology (GO): мітохондрії (GO:0005739). AKT1 – це білок з найвищим балом (0,900) за взаємодію з іншими білками, згідно з даними (на основі текстового аналізу, експериментів, баз даних та коекспресії). Вузли мережі представляють білки, а ребра – зв'язки між білками.
Оскільки метаболіти кишкової мікробіоти можуть регулювати епігенетичний склад через метилювання ДНК [32], ми досліджували, чи пов'язані рівні IPA у сироватці крові з метилюванням ДНК у печінці. Ми виявили, що два основні сайти метилювання, пов'язані з рівнями IPA у сироватці крові, знаходяться поблизу багатої на пролін-серин області 3 (C19orf55) та члена 6 родини білків теплового шоку B (малий) (HSPB6) (Додатковий файл 3). Метилювання ДНК 4350 CpG (p < 0,01) корелювало з рівнями IPA у сироватці крові та було збагачене регуляторними шляхами довголіття (p = 0,006) (Рисунок 1A, Таблиця 2 та Додатковий Рисунок 1C).
Щоб зрозуміти біологічні механізми, що лежать в основі зв'язків між рівнями IPA у сироватці крові, глобальними транскриптами, транскриптами, пов'язаними з мітохондріями, та метилюванням ДНК у печінці людини, ми провели аналіз перекриття генів, ідентифікованих у попередньому аналізі шляхів (Рисунок 1A). Результати аналізу збагачення шляхів 56 генів, що перекриваються (всередині чорної лінії на Рисунку 1A), показали, що шлях апоптозу (p = 0,00029) виділив два гени, спільні для трьох аналізів: AKT1 та YKT6 (гомолог YKT6 v-SNARE), як показано на діаграмі Венна (Додатковий Рисунок 2 та Рисунок 1A). Цікаво, що ми виявили, що AKT1 (cg19831386) та YKT6 (cg24161647) позитивно корелювали з рівнями IPA у сироватці крові (Додатковий файл 3). Щоб виявити потенційні білкові взаємодії між продуктами генів, ми вибрали 13 генів з найвищим балом спільної області (0,900) серед 56 генів, що перекриваються, як вхідні дані та побудували карту взаємодії. Згідно з рівнем достовірності (граничною достовірністю), ген AKT1 з найвищим балом (0,900) опинився на вершині (Рисунок 1B).
На основі аналізу шляхів ми виявили, що апоптоз був основним шляхом, тому ми дослідили, чи впливатиме обробка IPA на апоптоз HSCs in vitro. Раніше ми продемонстрували, що різні дози IPA (10 мкМ, 100 мкМ та 1 мМ) були нетоксичними для клітин LX-2 [15]. Це дослідження показало, що обробка IPA у концентраціях 10 мкМ та 100 мкМ збільшила кількість життєздатних та некротичних клітин. Однак, порівняно з контрольною групою, життєздатність клітин знижувалася при концентрації IPA 1 мМ, тоді як швидкість некрозу клітин залишалася незмінною (Рисунок 2A, B). Далі, щоб знайти оптимальну концентрацію для індукції апоптозу в клітинах LX-2, ми протестували IPA 10 мкМ, 100 мкМ та 1 мМ протягом 24 годин (Рисунок 2A-E та Додатковий Рисунок 3A-B). Цікаво, що IPA 10 мкМ та 100 мкМ знижували рівень апоптозу (%), проте IPA 1 мМ збільшував пізній апоптоз та рівень апоптозу (%) порівняно з контролем, і тому був обраний для подальших експериментів (рисунки 2A–D).
IPA індукує апоптоз клітин LX-2. Для кількісної оцінки швидкості апоптозу та морфології клітин за допомогою проточної цитометрії використовували метод подвійного фарбування Анексином V та 7-AAD. Клітини BA інкубували з 10 мкМ, 100 мкМ та 1 мМ IPA протягом 24 годин або з F–H TGF-β1 (5 нг/мл) та 1 мМ IPA у безсироватковому середовищі протягом 24 годин. A: живі клітини (Аннексин V -/ 7AAD-); B: некротичні клітини (Аннексин V -/ 7AAD+); C, F: ранні (Аннексин V +/ 7AAD-); D, G: пізні (Аннексин V+/7AAD.+); E, H: відсоток від загальної кількості ранніх та пізніх апоптотичних клітин у швидкості апоптозу (%). Дані виражені як середнє значення ± SD, n = 3 незалежні експерименти. Статистичні порівняння проводили за допомогою однофакторного ANOVA з post hoc тестом Бонферроні. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Як ми вже показали раніше, 5 нг/мл TGF-β1 може індукувати активацію HSC шляхом збільшення експресії класичних маркерних генів [15]. Клітини LX-2 обробляли комбінацією 5 нг/мл TGF-β1 та 1 мМ IPA (рис. 2E–H). Обробка TGF-β1 не змінила частоту апоптозу, проте спільна обробка IPA збільшила пізній апоптоз та частоту апоптозу (%) порівняно з обробкою TGF-β1 (рис. 2E–H). Ці результати вказують на те, що 1 мМ IPA може сприяти апоптозу в клітинах LX-2 незалежно від індукції TGF-β1.
Ми далі досліджували вплив IPA на мітохондріальне дихання в клітинах LX-2. Результати показали, що 1 мМ IPA знижував параметри швидкості споживання кисню (OCR): немітохондріальне дихання, базальне та максимальне дихання, витік протонів та продукцію АТФ порівняно з контрольною групою (Рисунок 3A, B), тоді як індекс біоенергетичного здоров'я (BHI) не змінювався.
IPA знижує мітохондріальне дихання в клітинах LX-2. Крива мітохондріального дихання (OCR) представлена ​​як параметри мітохондріального дихання (немітохондріальне дихання, базальне дихання, максимальне дихання, витік протонів, генерація АТФ, SRC та BHI). Клітини A та B інкубували з 10 мкМ, 100 мкМ та 1 мМ IPA протягом 24 годин відповідно. Клітини C та D інкубували з TGF-β1 (5 нг/мл) та 1 мМ IPA у безсироватковому середовищі протягом 24 годин відповідно. Всі вимірювання були нормалізовані відносно вмісту ДНК за допомогою набору CyQuant. BHI: біоенергетичний індекс здоров'я; SRC: резервна ємність дихання; OCR: швидкість споживання кисню. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD), n = 5 незалежних експериментів. Статистичні порівняння проводили за допомогою однофакторного ANOVA та post hoc тесту Бонферроні. *p < 0,05; **p < 0,01; та ***p < 0,001
Щоб отримати більш повне розуміння впливу IPA на біоенергетичний профіль клітин LX-2, активованих TGF-β1, ми проаналізували мітохондріальне окисне фосфорилювання за допомогою OCR (рис. 3C,D). Результати показали, що обробка TGF-β1 може знизити максимальне дихання, резервну здатність дихання (SRC) та BHI порівняно з контрольною групою (рис. 3C,D). Крім того, комбіноване лікування зменшило базальне дихання, витік протонів та вироблення АТФ, але SRC та BHI були значно вищими, ніж у тих, хто отримував TGF-β1 (рис. 3C,D).
Ми також провели «Тест фенотипу клітинної енергії», наданий програмним забезпеченням Seahorse (Додатковий рис. 4A–D). Як показано на Додатковому рис. 3B, метаболічні потенціали як OCR, так і ECAR знизилися після лікування TGF-β1, проте жодної різниці в групах комбінованого лікування та лікування IPA порівняно з контрольною групою не спостерігалося. Крім того, як базальний, так і стресовий рівні OCR знизилися після комбінованого лікування та лікування IPA порівняно з контрольною групою (Додатковий рис. 4C). Цікаво, що подібна картина спостерігалася при комбінованій терапії, де не спостерігалося змін базального та стресового рівнів ECAR порівняно з лікуванням TGF-β1 (Додатковий рис. 4C). У HSC зниження мітохондріального окисного фосфорилювання та здатність комбінованого лікування відновлювати SCR та BHI після впливу TGF-β1 не змінили метаболічний потенціал (OCR та ECAR). У сукупності ці результати вказують на те, що IPA може знижувати біоенергетику в HSC, що свідчить про те, що IPA може індукувати нижчий енергетичний профіль, який зміщує фенотип HSC у бік інактивації (Додатковий рис. 4D).
Вплив IPA на динаміку мітохондрій досліджували за допомогою тривимірної кількісної оцінки морфології мітохондрій та мережевих зв'язків, а також забарвлення MTR (Рисунок 4 та Додатковий Рисунок 5). На Рисунку 4 показано, що порівняно з контрольною групою, обробка TGF-β1 зменшила середню площу поверхні, кількість гілок, загальну довжину гілок та кількість з'єднань гілок (Рисунок 4A та B) та змінила частку мітохондрій від сферичної до проміжної морфології (Рисунок 4C). Тільки обробка IPA зменшила середній об'єм мітохондрій та змінила частку мітохондрій від сферичної до проміжної морфології порівняно з контрольною групою (Рисунок 4A). Натомість, сферичність, середня довжина гілок та мітохондріальна активність, оцінені за допомогою MTR, залежного від потенціалу мітохондріальної мембрани (Рисунок 4A та E), залишилися незмінними, і ці параметри не відрізнялися між групами. Взяті разом, ці результати свідчать про те, що обробка TGF-β1 та IPA, здається, модулює форму та розмір мітохондрій, а також складність мережі в живих клітинах LX-2.
IPA змінює динаміку мітохондрій та кількість мітохондріальної ДНК у клітинах LX-2. A. Репрезентативні конфокальні зображення живих клітин LX-2, інкубованих з TGF-β1 (5 нг/мл) та 1 мМ IPA протягом 24 годин у безсироватковому середовищі, що показують мітохондріальні мережі, забарвлені Mitotracker™ Red CMXRos, та ядра, забарвлені в синій колір за допомогою DAPI. Всі дані містили щонайменше 15 зображень на групу. Ми отримали 10 зображень Z-стеку для кожного типу зразка. Кожна послідовність по осі Z містила 30 зрізів, кожен товщиною 9,86 мкм. Масштабна шкала: 10 мкм. B. Репрезентативні об'єкти (лише мітохондрії), ідентифіковані шляхом застосування адаптивного порогового значення до зображення. Кількісний аналіз та порівняння зв'язків морфологічної мережі мітохондрій було проведено для всіх клітин у кожній групі. C. Частота співвідношень форм мітохондрій. Значення, близькі до 0, вказують на сферичні форми, а значення, близькі до 1, вказують на ниткоподібні форми. D Вміст мітохондріальної ДНК (мтДНК) визначали, як описано в розділі "Матеріали та методи". Аналіз E Mitotracker™ Red CMXRos проводили за допомогою проточної цитометрії (30 000 подій), як описано в розділі «Матеріали та методи». Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, n = 3 незалежні експерименти. Статистичні порівняння проводили за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) та постфактумного тесту Бонферроні. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Потім ми проаналізували вміст мтДНК у клітинах LX-2 як показник кількості мітохондрій. Порівняно з контрольною групою, вміст мтДНК був підвищений у групі, обробленій TGF-β1 (Рисунок 4D). Порівняно з групою, обробленою TGF-β1, вміст мтДНК був зменшений у групі комбінованого лікування (Рисунок 4D), що свідчить про те, що IPA може знижувати вміст мтДНК і, можливо, кількість мітохондрій, а також мітохондріальне дихання (Рисунок 3C). Більше того, IPA, здається, знижував вміст мтДНК у комбінованому лікуванні, але не впливав на мітохондріальну активність, опосередковану MTR (Рисунки 4A–C).
Ми досліджували зв'язок IPA з рівнями мРНК генів, пов'язаних з фіброзом, апоптозом, виживанням та динамікою мітохондрій у клітинах LX-2 (Рисунок 5A–D). Порівняно з контрольною групою, група, яка отримувала TGF-β1, показала підвищену експресію таких генів, як ланцюг колагену типу I α2 (COL1A2), α-актин гладких м'язів (αSMA), матриксна металопротеїназа 2 (MMP2), тканинний інгібітор металопротеїнази 1 (TIMP1) та ген, подібний до динаміну 1 (DRP1), що вказує на посилення фіброзу та активації. Крім того, порівняно з контрольною групою, лікування TGF-β1 знизило рівні мРНК ядерного рецептора прегнану X (PXR), каспази 8 (CASP8), MAPKAPK3, інгібітора B-клітин α, енхансера легкого пептиду гена ядерного фактора κ (NFκB1A) та інгібітора субодиниці кінази ядерного фактора κB β (IKBKB) (Рисунок 5A–D). Порівняно з лікуванням TGF-β1, комбіноване лікування TGF-β1 та IPA знизило експресію COL1A2 та MMP2, але підвищило рівні мРНК PXR, TIMP1, В-клітинної лімфоми-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β та IKBKB. Лікування IPA значно знизило експресію MMP2, білка X, асоційованого з Bcl-2 (BAX), AKT1, білка оптичної атрофії 1 (OPA1) та мітохондріального білка злиття 2 (MFN2), тоді як експресія CASP8, NFκB1A, NFκB1B та IKBKB була підвищена порівняно з контрольною групою. Однак, різниці в експресії каспази-3 (CASP3), фактора активації апоптотичної пептидази 1 (APAF1), мітохондріального білка злиття 1 (MFN1) та білка поділу 1 (FIS1) не виявлено. У сукупності ці результати свідчать про те, що лікування IPA модулює експресію генів, пов'язаних з фіброзом, апоптозом, виживанням та динамікою мітохондрій. Наші дані свідчать про те, що лікування IPA зменшує фіброз у клітинах LX-2; водночас воно стимулює виживання, зміщуючи фенотип у бік інактивації.
IPA модулює експресію генів фібробластів, апоптозу, життєздатності та мітохондріальної динаміки в клітинах LX-2. Гістограми відображають експресію мРНК відносно ендогенного контролю (RPLP0 або PPIA) після індукції клітин LX-2 TGF-β1 та IPA у безсироватковому середовищі протягом 24 годин. A вказує на фібробласти, B вказує на апоптотичні клітини, C вказує на клітини, що вижили, а D вказує на експресію генів мітохондріальної динаміки. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD), n = 3 незалежних експерименти. Статистичні порівняння проводили за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) та тесту Бонферроні post hoc. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Потім зміни розміру клітин (FSC-H) та цитоплазматичної складності (SSC-H) оцінювали за допомогою проточної цитометрії (рис. 6A, B), а зміни морфології клітин після обробки IPA оцінювали за допомогою просвічувальної електронної мікроскопії (TEM) та фазово-контрастної мікроскопії (додатковий рис. 6A-B). Як і очікувалося, клітини в групі, обробленій TGF-β1, збільшилися в розмірі порівняно з контрольною групою (рис. 6A, B), демонструючи класичне розширення шорсткого ендоплазматичного ретикулуму (ER*) та фаголізосом (P), що вказує на активацію гемопоетичних стовбурових клітин (HSC) (додатковий рис. 6A). Однак, порівняно з групою, обробленою TGF-β1, розмір клітин, цитоплазматична складність (рис. 6A, B) та вміст ER* зменшилися в групі комбінованого лікування TGF-β1 та IPA (додатковий рис. 6A). Крім того, обробка IPA зменшила розмір клітин, цитоплазматичну складність (рис. 6A, B), вміст P та ER* (додатковий рис. 6A) порівняно з контрольною групою. Крім того, вміст апоптотичних клітин збільшився після 24 годин обробки IPA порівняно з контрольною групою (білі стрілки, Додатковий рис. 6B). У сукупності ці результати свідчать про те, що 1 мМ IPA може стимулювати апоптоз HSC та зворотно впливати на зміни морфологічних параметрів клітин, індуковані TGF-β1, тим самим регулюючи розмір та складність клітин, що може бути пов'язано з інактивацією HSC.
IPA змінює розмір клітин та цитоплазматичну складність у клітинах LX-2. Типові зображення аналізу проточної цитометрії. В аналізі використовувалася стратегія гейтингу, специфічна для клітин LX-2: SSC-A/FSC-A для визначення популяції клітин, FSC-H/FSC-A для ідентифікації дублетів та SSC-H/FSC-H для аналізу розміру та складності клітин. Клітини інкубували з TGF-β1 (5 нг/мл) та 1 мМ IPA у безсироватковому середовищі протягом 24 годин. Клітини LX-2 розподіляли у нижній лівий квадрант (SSC-H-/FSC-H-), верхній лівий квадрант (SSC-H+/FSC-H-), нижній правий квадрант (SSC-H-/FSC-H+) та верхній правий квадрант (SSC-H+/FSC-H+) для аналізу розміру клітин та цитоплазматичної складності. B. Морфологію клітин аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням FSC-H (прямий розсіювання, розмір клітин) та SSC-H (бічний розсіювання, цитоплазматична складність) (30 000 подій). Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення, n = 3 незалежні експерименти. Статистичні порівняння проводили за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) та постфактумного тесту Бонферроні. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 та ****p < 0,0001
Кишкові метаболіти, такі як IPA, стали гарячою темою досліджень, що свідчить про можливість виявлення нових мішеней у кишковій мікробіоті. Тому цікаво, що IPA, метаболіт, який ми пов'язали з фіброзом печінки у людей [15], був показаний як потенційна антифібротична сполука на тваринних моделях [13, 14]. Тут ми вперше демонструємо зв'язок між сироватковим IPA та глобальною транскриптомікою печінки, а також метилюванням ДНК у людей з ожирінням без діабету 2 типу (ЦД2), висвітлюючи апоптоз, мітофагію та довголіття, а також можливий ген-кандидат AKT1, що регулює гомеостаз печінки. Ще однією новизною нашого дослідження є те, що ми продемонстрували взаємодію лікування IPA з апоптозом, морфологією клітин, мітохондріальною біоенергетикою та динамікою в клітинах LX-2, що вказує на нижчий енергетичний спектр, який зміщує фенотип HSC у бік інактивації, що робить IPA потенційним кандидатом для покращення фіброзу печінки.
Ми виявили, що апоптоз, мітофагія та довголіття були найважливішими канонічними шляхами, збагаченими генами печінки, пов'язаними з циркулюючим сироватковим IPA. Порушення системи контролю якості мітохондрій (MQC) може призвести до мітохондріальної дисфункції, мітофагії та апоптозу, тим самим сприяючи виникненню MASLD [33, 34]. Таким чином, ми можемо припустити, що IPA може бути залучений до підтримки динаміки клітин та цілісності мітохондрій через апоптоз, мітофагію та довголіття в печінці. Наші дані показали, що два гени були спільними для трьох аналізів: YKT6 та AKT1. Варто зазначити, що YKT6 - це білок SNARE, який бере участь у процесі злиття клітинних мембран. Він відіграє роль в аутофагії та мітофагії, утворюючи ініціаційний комплекс з STX17 та SNAP29 на аутофагосомі, тим самим сприяючи злиттю аутофагосом та лізосом [35]. Крім того, втрата функції YKT6 призводить до порушення мітофагії [36], тоді як підвищена регуляція YKT6 пов'язана з прогресуванням гепатоцелюлярної карциноми (HCC), що демонструє підвищену виживаність клітин [37]. З іншого боку, AKT1 є найважливішим взаємодіючим геном і відіграє важливу роль у захворюваннях печінки, включаючи сигнальний шлях PI3K/AKT, клітинний цикл, міграцію клітин, проліферацію, фокальну адгезію, мітохондріальну функцію та секрецію колагену [38–40]. Активований сигнальний шлях PI3K/AKT може активувати гемопоетичні стовбурові клітини (HSCs), які є клітинами, відповідальними за вироблення позаклітинного матриксу (ECM), і його порушення регуляції може сприяти виникненню та прогресуванню фіброзу печінки [40]. Крім того, AKT є одним з ключових факторів виживання клітин, що пригнічує p53-залежний апоптоз клітин, а активація AKT може бути пов'язана з пригніченням апоптозу клітин печінки [41, 42]. Отримані результати свідчать про те, що IPA може бути залучений до апоптозу, пов'язаного з мітохондріями печінки, впливаючи на рішення гепатоцитів між вступом в апоптоз або виживанням. Ці ефекти можуть регулюватися генами-кандидатами AKT та/або YKT6, які є критичними для гомеостазу печінки.
Наші результати показали, що 1 мМ IPA індукував апоптоз і зменшував мітохондріальне дихання в клітинах LX-2 незалежно від лікування TGF-β1. Варто зазначити, що апоптоз є основним шляхом для вирішення фіброзу та активації гемопоетичних стовбурових клітин (HSC), а також є ключовою подією в оборотній фізіологічній відповіді на фіброз печінки [4, 43]. Більше того, відновлення BHI в клітинах LX-2 після комбінованого лікування дало нове розуміння потенційної ролі IPA в регуляції мітохондріальної біоенергетики. В умовах спокою та неактивності гемопоетичні клітини зазвичай використовують мітохондріальне окисне фосфорилювання для вироблення АТФ і мають низьку метаболічну активність. З іншого боку, активація HSC посилює мітохондріальне дихання та біосинтез, щоб компенсувати енергетичні потреби переходу в гліколітичний стан [44]. Той факт, що IPA не впливав на метаболічний потенціал та ECAR, свідчить про те, що гліколітичний шлях має менший пріоритет. Аналогічно, інше дослідження показало, що 1 мМ IPA здатний модулювати активність мітохондріального дихального ланцюга в кардіоміоцитах, клітинній лінії гепатоцитів людини (Huh7) та ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC); Однак, жодного впливу IPA на гліколіз у кардіоміоцитах не було виявлено, що свідчить про те, що IPA може впливати на біоенергетику інших типів клітин [45]. Тому ми припускаємо, що 1 мМ IPA може діяти як м'який хімічний роз'єднувач, оскільки він може значно зменшити експресію фіброгенних генів, морфологію клітин та мітохондріальну біоенергетику без зміни кількості мтДНК [46]. Мітохондріальні роз'єднувачі можуть пригнічувати індукований культурою фіброз та активацію ГСК [47], а також зменшувати вироблення мітохондріального АТФ, регульоване або індуковане певними білками, такими як роз'єднувальні білки (UCP) або аденіннуклеотидна транслоказа (ANT). Залежно від типу клітин, це явище може захищати клітини від апоптозу та/або сприяти апоптозу [46]. Однак, необхідні подальші дослідження, щоб з'ясувати роль IPA як мітохондріального роз'єднувача в інактивації гемопоетичних стовбурових клітин.
Потім ми дослідили, чи відображаються зміни в мітохондріальному диханні на морфології мітохондрій у живих клітинах LX-2. Цікаво, що обробка TGF-β1 змінює пропорцію мітохондрій зі сферичної на проміжну, зі зменшенням розгалуження мітохондрій та збільшенням експресії DRP1, ключового фактора мітохондріального поділу [48]. Крім того, фрагментація мітохондрій пов'язана із загальною складністю мережі, а перехід від злиття до поділу є критичним для активації гемопоетичних стовбурових клітин (HSC), тоді як пригнічення мітохондріального поділу призводить до апоптозу HSC [49]. Таким чином, наші результати показують, що обробка TGF-β1 може викликати зниження складності мітохондріальної мережі зі зменшенням розгалуження, що частіше зустрічається при мітохондріальному поділі, пов'язаному з активованими гемопоетичними стовбуровими клітинами (HSC). Крім того, наші дані показали, що IPA може змінити пропорцію мітохондрій зі сферичної на проміжну форму, тим самим зменшуючи експресію OPA1 та MFN2. Дослідження показали, що зниження регуляції OPA1 може спричинити зниження потенціалу мітохондріальної мембрани та спровокувати апоптоз клітин [50]. Відомо, що MFN2 опосередковує мітохондріальне злиття та апоптоз [51]. Отримані результати свідчать про те, що індукція клітин LX-2 за допомогою TGF-β1 та/або IPA, ймовірно, модулює форму та розмір мітохондрій, а також стан активації та складність мережі.
Наші результати показують, що комбіноване лікування TGFβ-1 та IPA може знизити параметри мтДНК та морфології клітин шляхом регуляції експресії мРНК генів фіброзу, апоптозу та виживання в клітинах, що уникають апоптозу. Дійсно, IPA знижував рівень експресії мРНК AKT1 та важливих генів фіброзу, таких як COL1A2 та MMP2, але підвищував рівень експресії CASP8, який пов'язаний з апоптозом. Наші результати показали, що після лікування IPA експресія BAX знижувалася, а експресія мРНК субодиниць родини TIMP1, BCL-2 та NF-κB збільшувалася, що свідчить про те, що IPA може стимулювати сигнали виживання в гемопоетичних стовбурових клітинах (HSCs), які уникають апоптозу. Ці молекули можуть діяти як сигнали виживання в активованих гемопоетичних стовбурових клітинах, що може бути пов'язано зі збільшенням експресії антиапоптотичних білків (таких як Bcl-2), зменшенням експресії проапоптотичного BAX та складною взаємодією між TIMP та NF-κB [5, 7]. IPA здійснює свою дію через PXR, і ми виявили, що комбіноване лікування TGF-β1 та IPA підвищує рівень експресії мРНК PXR, що вказує на пригнічення активації HSC. Відомо, що активована сигналізація PXR пригнічує активацію HSC як in vivo, так і in vitro [52, 53]. Наші результати показують, що IPA може брати участь у кліренсі активованих HSC, сприяючи апоптозу, зменшуючи фіброз та мітохондріальний метаболізм, а також посилюючи сигнали виживання, які є типовими процесами, що перетворюють активований фенотип HSC на інактивований. Іншим можливим поясненням потенційного механізму та ролі IPA в апоптозі є те, що він поглинає дисфункціональні мітохондрії переважно через мітофагію (внутрішній шлях) та зовнішній сигнальний шлях TNF (Таблиця 1), який безпосередньо пов'язаний із сигнальним шляхом виживання NF-κB (Додатковий рисунок 7). Цікаво, що збагачені IPA гени здатні індукувати проапоптотичні та про-виживальні сигнали в апоптотичному шляху [54], що свідчить про те, що IPA може індукувати апоптотичний шлях або виживання, взаємодіючи з цими генами. Однак, як IPA індукує апоптоз або виживання під час активації HSC та його механістичні шляхи залишаються незрозумілими.
IPA – це мікробний метаболіт, що утворюється з харчового триптофану через кишкову мікробіоту. Дослідження показали, що він має протизапальні, антиоксидантні та епігенетичні регуляторні властивості в кишковому середовищі.[55] Дослідження показали, що IPA може модулювати функцію кишкового бар'єра та зменшувати оксидативний стрес, що може сприяти його місцевим фізіологічним ефектам.[56] Фактично, IPA транспортується до органів-мішеней через кровообіг, і оскільки IPA має схожу структуру основного метаболіту з триптофаном, серотоніном та похідними індолу, IPA здійснює метаболічну дію, що призводить до конкурентної метаболічної долі.[52] IPA може конкурувати з метаболітами, отриманими з триптофану, за місця зв'язування на ферментах або рецепторах, потенційно порушуючи нормальні метаболічні шляхи. Це підкреслює необхідність подальших досліджень його фармакокінетики та фармакодинаміки для кращого розуміння його терапевтичного вікна.[57] Залишається з'ясувати, чи може це також відбуватися в гемопоетичних стовбурових клітинах (ГСК).
Ми визнаємо, що наше дослідження має деякі обмеження. Щоб спеціально вивчити зв'язки, пов'язані з IPA, ми виключили пацієнтів з цукровим діабетом 2 типу (ЦД2). Ми визнаємо, що це обмежує широку застосовність наших результатів до пацієнтів з цукровим діабетом 2 типу та запущеними захворюваннями печінки. Хоча фізіологічна концентрація IPA у сироватці крові людини становить 1–10 мкМ [11, 20], концентрацію 1 мМ IPA було обрано на основі найвищої нетоксичної концентрації [15] та найвищого рівня апоптозу, без різниці у відсотку популяції некротичних клітин. Хоча в цьому дослідженні використовувалися супрафізіологічні рівні IPA, наразі немає єдиної думки щодо ефективної дози IPA [52]. Хоча наші результати є значними, ширша метаболічна доля IPA залишається активною сферою досліджень. Більше того, наші висновки щодо зв'язку між рівнями IPA у сироватці крові та метилюванням ДНК транскриптів печінки були отримані не лише з гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК), але й з тканин печінки. Ми вирішили використовувати людські клітини LX-2 на основі наших попередніх висновків, отриманих в результаті аналізу транскриптомів, що IPA пов'язаний з активацією гемопоетичних стовбурових клітин (HSC) [15], а HSC є основними клітинами, що беруть участь у прогресуванні фіброзу печінки. Печінка складається з кількох типів клітин, тому для вивчення ролі IPA та його взаємодії з іншими типами клітин печінки слід розглянути інші клітинні моделі, такі як система спільного культивування гепатоцитів-HSC-імунних клітин у поєднанні з активацією каспази та фрагментацією ДНК, а також механізм дії, включаючи рівень білка.