Дякуємо за відвідування сайту nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращої роботи рекомендуємо використовувати останню версію браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Крім того, для забезпечення постійної підтримки цей сайт не міститиме стилів або JavaScript.
Сірководень (H2S) має численні фізіологічні та патологічні ефекти на організм людини. Гідросульфід натрію (NaHS) широко використовується як фармакологічний інструмент для оцінки впливу H2S у біологічних експериментах. Хоча втрата H2S з розчинів NaHS займає лише кілька хвилин, розчини NaHS використовувалися як донорні сполуки для H2S у питній воді в деяких дослідженнях на тваринах. У цьому дослідженні вивчалося, чи може питна вода з концентрацією NaHS 30 мкМ, приготована у пляшках для щурів/мишей, залишатися стабільною протягом щонайменше 12–24 годин, як пропонують деякі автори. Приготуйте розчин NaHS (30 мкМ) у питній воді та негайно налийте його у пляшки для води для щурів/мишей. Зразки збирали з кінчика та внутрішньої частини пляшки для води через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 та 24 години для вимірювання вмісту сульфіду за допомогою методу метиленового синього. Крім того, самцям і самкам щурів протягом двох тижнів вводили NaHS (30 мкМ), а концентрацію сульфіду в сироватці крові вимірювали через день протягом першого тижня та наприкінці другого тижня. Розчин NaHS у зразку, отриманому з кінчика пляшки з водою, був нестабільним; він зменшився на 72% та 75% через 12 та 24 години відповідно. У зразках, отриманих зсередини пляшок з водою, зниження NaHS не було значним протягом 2 годин; однак воно знизилося на 47% та 72% через 12 та 24 години відповідно. Ін'єкція NaHS не вплинула на рівень сульфіду в сироватці крові самців і самок щурів. На завершення, розчини NaHS, приготовані з питної води, не слід використовувати для донації H2S, оскільки розчин нестабільний. Такий шлях введення призведе до нерегулярного та меншого, ніж очікувалося, впливу на тварин кількостей NaHS.
Сірководень (H2S) використовується як токсин з 1700 року; однак його можливу роль як ендогенної біосигнальної молекули описали Абе та Кімура у 1996 році. Протягом останніх трьох десятиліть було з'ясовано численні функції H2S у різних системах людини, що призвело до усвідомлення того, що молекули-донори H2S можуть мати клінічне застосування в лікуванні або веденні певних захворювань; див. нещодавній огляд у Chirino et al.
Гідросульфід натрію (NaHS) широко використовується як фармакологічний інструмент для оцінки впливу H2S у багатьох дослідженнях на клітинних культурах та тваринах5,6,7,8. Однак NaHS не є ідеальним донором H2S, оскільки він швидко перетворюється на H2S/HS- у розчині, легко забруднюється полісульфідами, легко окислюється та випаровується4,9. У багатьох біологічних експериментах NaHS розчиняється у воді, що призводить до пасивного випаровування та втрати H2S10,11,12, спонтанного окислення H2S11,12,13 та фотолізу14. Сульфід у вихідному розчині втрачається дуже швидко через випаровування H2S11. У відкритому контейнері період напіврозпаду (t1/2) H2S становить близько 5 хвилин, а його концентрація зменшується приблизно на 13% за хвилину10. Хоча втрата сірководню з розчинів NaHS займає лише кілька хвилин, у деяких дослідженнях на тваринах розчини NaHS використовувалися як джерело сірководню у питній воді протягом 1–21 тижня, замінюючи розчин, що містить NaHS, кожні 12–24 години.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Така практика не відповідає принципам наукових досліджень, оскільки дозування ліків має базуватися на їх застосуванні у інших видів, особливо у людей.27
Доклінічні дослідження в біомедицині спрямовані на покращення якості догляду за пацієнтами або результатів лікування. Однак результати більшості досліджень на тваринах ще не були перенесені на людей28,29,30. Однією з причин цієї невдачі в трансляції є брак уваги до методологічної якості досліджень на тваринах30. Тому метою цього дослідження було з'ясувати, чи можуть 30 мкМ розчини NaHS, приготовані в пляшках з водою для щурів/мишей, залишатися стабільними у питній воді протягом 12–24 годин, як стверджується або пропонується в деяких дослідженнях.
Усі експерименти в цьому дослідженні проводилися відповідно до опублікованих рекомендацій щодо догляду та використання лабораторних тварин в Ірані31. Усі експериментальні звіти в цьому дослідженні також відповідали рекомендаціям ARRIVE32. Етичний комітет Інституту ендокринних наук Медичного університету імені Шахіда Бехешті схвалив усі експериментальні процедури в цьому дослідженні.
Дигідрат ацетату цинку (CAS: 5970-45-6) та безводний хлорид заліза (CAS: 7705-08-0) були придбані у Biochem, Chemopahrama (Косн-сюр-Луар, Франція). Гідрат гідросульфіду натрію (CAS: 207683-19-0) та N,N-диметил-п-фенілендіамін (DMPD) (CAS: 535-47-0) були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Ізофлуран був придбаний у Piramal (Віфлеєм, Пенсільванія, США). Хлоридна кислота (HCl) була придбана у Merck (Дармштадт, Німеччина).
Приготуйте розчин NaHS (30 мкМ) у питній воді та негайно налийте його у пляшки для води для щурів/мишей. Цю концентрацію було обрано на основі численних публікацій, що використовують NaHS як джерело H2S; див. розділ «Обговорення». NaHS – це гідратована молекула, яка може містити різну кількість гідратної води (тобто NaHS•xH2O); за даними виробника, відсоток NaHS, використаного в нашому дослідженні, становив 70,7% (тобто NaHS•1,3 H2O), і ми врахували це значення в наших розрахунках, де використовували молекулярну масу 56,06 г/моль, що є молекулярною масою безводного NaHS. Гідратаційна вода (також звана кристалізаційною водою) – це молекули води, що утворюють кристалічну структуру33. Гідрати мають різні фізичні та термодинамічні властивості порівняно з ангідратами34.
Перед додаванням NaHS до питної води виміряйте pH та температуру розчинника. Негайно вилийте розчин NaHS у пляшку з водою для щурів/мишей у клітці тварин. Зразки збирали з кінчика та зсередини пляшки з водою через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 та 24 години для вимірювання вмісту сульфідів. Вимірювання сульфідів проводили одразу після кожного відбору проб. Ми отримували зразки з кінчика пробірки, оскільки деякі дослідження показали, що малий розмір пор пробірки з водою може мінімізувати випаровування H2S15,19. Ця проблема, здається, стосується і розчину в пляшці. Однак це не стосувалося розчину в шийці пляшки з водою, який мав вищу швидкість випаровування та самоокислювався; насправді, тварини спочатку пили цю воду.
У дослідженні використовували самців та самок щурів лінії Вістар. Щурів утримували в поліпропіленових клітках (2–3 щури в клітці) за стандартних умов (температура 21–26 °C, вологість 32–40%) з 12 годинами світла (з 7:00 до 19:00) та 12 годинами темряви (з 19:00 до 7:00). Щури мали вільний доступ до водопровідної води та годували стандартним кормом (Khorak Dam Pars Company, Тегеран, Іран). Щурів Вістар, підібраних за віком (6 місяців), самок (n=10, маса тіла: 190–230 г) та самців (n=10, маса тіла: 320–370 г), випадковим чином розділили на контрольну групу та групу, оброблену NaHS (30 мкМ) (n=5 на групу). Для визначення розміру вибірки ми використовували підхід KISS (Keep It Simple, Stupid), який поєднує попередній досвід та аналіз потужності35. Спочатку ми провели пілотне дослідження на 3 щурах та визначили середній рівень загального сульфіду в сироватці крові та стандартне відхилення (8,1 ± 0,81 мкМ). Потім, враховуючи потужність 80% та припускаючи двосторонній рівень значущості 5%, ми визначили попередній розмір вибірки (n = 5 на основі попередньої літератури), який відповідав стандартизованому розміру ефекту 2,02 із заздалегідь визначеним значенням, запропонованим Фестінгом для розрахунку розміру вибірки експериментальних тварин35. Після множення цього значення на стандартне відхилення (2,02 × 0,81), прогнозований розмір виявленого ефекту (1,6 мкМ) становив 20%, що є прийнятним. Це означає, що n = 5/група достатньо для виявлення 20% середньої зміни між групами. Щурів випадковим чином розділили на контрольну групу та групу, оброблену NaSH, за допомогою функції випадкового вибору програмного забезпечення Excel36 (Додатковий рис. 1). Засліплення проводилося на рівні результату, і дослідники, які проводили біохімічні вимірювання, не знали про розподіл за групами.
Групи NaHS обох статей обробляли 30 мкМ розчином NaHS, приготованим у питній воді, протягом 2 тижнів; свіжий розчин подавали кожні 24 години, протягом яких вимірювали масу тіла. Зразки крові збирали з кінчиків хвостів усіх щурів під ізофлурановим наркозом через день в кінці першого та другого тижнів. Зразки крові центрифугували при 3000 g протягом 10 хвилин, сироватку відокремлювали та зберігали при температурі –80°C для подальшого вимірювання сечовини, креатиніну (Cr) та загального сульфіду в сироватці крові. Сечовину сироватки визначали ферментативним уреазним методом, а креатинін сироватки – фотометричним методом Яффе з використанням комерційно доступних наборів (Man Company, Тегеран, Іран) та автоматичного аналізатора (Selectra E, серійний номер 0-2124, Нідерланди). Внутрішньо- та міжлабораторні коефіцієнти варіації для сечовини та Cr були менше 2,5%.
Метод метиленового синього (MB) використовується для вимірювання загального вмісту сульфіду в питній воді та сироватці крові, що містить NaHS; MB є найпоширенішим методом вимірювання сульфіду в об'ємних розчинах та біологічних зразках11,37. Метод MB можна використовувати для оцінки загального пулу сульфідів38 та вимірювання неорганічних сульфідів у формі H2S, HS- та S2 у водній фазі39. У цьому методі сірка осаджується у вигляді сульфіду цинку (ZnS) у присутності ацетату цинку11,38. Осадження ацетатом цинку є найширше використовуваним методом відділення сульфідів від інших хромофорів11. ZnS повторно розчиняли за допомогою HCl11 у сильнокислих умовах. Сульфід реагує з DMPD у стехіометричному співвідношенні 1:2 у реакції, каталізованій хлоридом заліза (Fe3+ діє як окислювач), утворюючи барвник MB, який виявляється спектрофотометрично при 670 нм40,41. Межа виявлення методу MB становить приблизно 1 мкМ11.
У цьому дослідженні 100 мкл кожного зразка (розчину або сироватки) додавали в пробірку; потім додавали 200 мкл ацетату цинку (1% w/v у дистильованій воді), 100 мкл DMPD (20 мМ у 7,2 М HCl) та 133 мкл FeCl3 (30 мМ у 1,2 М HCl). Суміш інкубували при 37°C у темряві протягом 30 хвилин. Розчин центрифугували при 10 000 g протягом 10 хвилин, а поглинання супернатанту зчитували при 670 нм за допомогою планшетного рідера (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, США). Концентрації сульфідів визначали за допомогою калібрувальної кривої NaHS (0–100 мкМ) у ddH2O (Додатковий рис. 2). Усі розчини, що використовувалися для вимірювань, були свіжоприготованими. Внутрішньо- та міжлабораторні коефіцієнти варіації для вимірювань сульфідів становили 2,8% та 3,4% відповідно. Ми також визначили загальний вміст сульфіду, видобутого з питної води та зразків сироватки, що містять тіосульфат натрію, за допомогою методу збагачених зразків42. Видобутість для зразків питної води та сироватки, що містять тіосульфат натрію, становила 91 ± 1,1% (n = 6) та 93 ± 2,4% (n = 6) відповідно.
Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism версії 8.0.2 для Windows (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США, www.graphpad.com). Для порівняння температури та pH питної води до та після додавання NaHS використовували парний t-критерій. Втрату H2S у розчині, що містить NaHS, розраховували як відсоткове зменшення від базового рівня поглинання, і для оцінки статистично значущої втрати ми провели однофакторний дисперсійний аналіз з повторними вимірюваннями, а потім тест множинних порівнянь Даннета. Масу тіла, рівень сечовини сироватки крові, креатиніну сироватки крові та загальний рівень сульфіду сироватки крові з плином часу порівнювали між контрольними щурами різної статі та щурами, які отримували NaHS, за допомогою двофакторного змішаного (між-всередині) дисперсійного аналізу, а потім постфакторного тесту Бонферроні. Двосторонні значення P ​​< 0,05 вважалися статистично значущими.
Значення pH питної води становило 7,60 ± 0,01 до додавання NaHS та 7,71 ± 0,03 після додавання NaHS (n = 13, p = 0,0029). Температура питної води становила 26,5 ± 0,2 та знизилася до 26,2 ± 0,2 після додавання NaHS (n = 13, p = 0,0128). Приготуйте 30 мкМ розчин NaHS у питній воді та зберігайте його у пляшці для води. Розчин NaHS нестабільний, і його концентрація з часом зменшується. Під час відбору проб з горлечка пляшки для води спостерігалося значне зниження (68,0%) протягом першої години, а вміст NaHS у розчині зменшився на 72% та 75% через 12 та 24 години відповідно. У зразках, отриманих з пляшок для води, зниження NaHS не було значним до 2 годин, але через 12 та 24 години воно зменшилося на 47% та 72% відповідно. Ці дані вказують на те, що відсоток NaHS у розчині 30 мкМ, приготованому у питній воді, зменшився приблизно до чверті від початкового значення через 24 години, незалежно від місця відбору проб (Рисунок 1).
Стабільність розчину NaHS (30 мкМ) у питній воді у пляшках для щурів/мишей. Після приготування розчину зразки були взяті з наконечника та внутрішньої частини пляшки для води. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (n = 6/група). * та #, P < 0,05 порівняно з часом 0. На фотографії пляшки для води показано наконечник (з отвором) та корпус пляшки. Об'єм наконечника становить приблизно 740 мкл.
Концентрація NaHS у свіжоприготованому розчині 30 мкМ становила 30,3 ± 0,4 мкМ (діапазон: 28,7–31,9 мкМ, n = 12). Однак через 24 години концентрація NaHS знизилася до нижчого значення (середнє значення: 3,0 ± 0,6 мкМ). Як показано на рисунку 2, концентрації NaHS, яким піддавалися щури, не були постійними протягом періоду дослідження.
Маса тіла самок щурів з часом значно збільшилася (з 205,2 ± 5,2 г до 213,8 ​​± 7,0 г у контрольній групі та з 204,0 ± 8,6 г до 211,8 ± 7,5 г у групі, обробленій NaHS); однак обробка NaHS не вплинула на масу тіла (рис. 3). Маса тіла самців щурів з часом значно збільшилася (з 338,6 ± 8,3 г до 352,4 ± 6,0 г у контрольній групі та з 352,4 ± 5,9 г до 363,2 ± 4,3 г у групі, обробленій NaHS); однак обробка NaHS не вплинула на масу тіла (рис. 3).
Зміни маси тіла у самок та самців щурів після введення NaHS (30 мкМ). Дані представлені як середнє значення ± SEM та порівнювалися за допомогою двофакторного змішаного (в межах) дисперсійного аналізу з post hoc тестом Бонферроні. n = 5 кожної статі в кожній групі.
Концентрації сечовини та креатинфосфату в сироватці крові були порівнянними у контрольної групи та щурів, які отримували NaSH, протягом усього дослідження. Крім того, лікування NaSH не впливало на концентрації сечовини та креатинхрому в сироватці крові (Таблиця 1).
Базові концентрації загального сульфіду в сироватці крові були порівнянними у контрольної групи щурів самців (8,1 ± 0,5 мкМ проти 9,3 ± 0,2 мкМ) і самок (9,1 ± 1,0 мкМ проти 6,1 ± 1,1 мкМ) та щурів, оброблених NaHS. Введення NaHS протягом 14 днів не вплинуло на рівень загального сульфіду в сироватці крові ні у самців, ні у самок щурів (рис. 4).
Зміни загальної концентрації сульфіду в сироватці крові самців та самок щурів після введення NaHS (30 мкМ). Дані представлені як середнє значення ± SEM та порівнювалися за допомогою двофакторного змішаного (всередині-всередині) дисперсійного аналізу з post hoc тестом Бонферроні. Кожна стать, n = 5/група.
Головний висновок цього дослідження полягає в тому, що питна вода, що містить NaHS, є нестабільною: лише близько чверті початкового загального вмісту сульфідів можна виявити через 24 години після відбору проб з кінчика та всередині пляшок для води щурів/мишей. Крім того, щури зазнавали впливу нестабільних концентрацій NaHS через втрату H2S у розчині NaHS, а додавання NaHS до питної води не вплинуло на масу тіла, рівень сечовини та креатиніну-хрому в сироватці крові, а також на загальний вміст сульфіду в сироватці крові.
У цьому дослідженні швидкість втрати H2S з розчинів NaHS з концентрацією 30 мкМ, приготованих у питній воді, становила приблизно 3% на годину. У буферному розчині (100 мкМ сульфіду натрію в 10 мМ PBS, pH 7,4) повідомлялося, що концентрація сульфіду зменшується на 7% з часом протягом 8 годин11. Раніше ми захищали внутрішньочеревне введення NaHS, повідомляючи, що швидкість втрати сульфіду з розчину NaHS з концентрацією 54 мкМ у питній воді становила приблизно 2,3% на годину (4%/годину протягом перших 12 годин та 1,4%/годину протягом останніх 12 годин після приготування)8. Попередні дослідження43 виявили постійну втрату H2S з розчинів NaHS, головним чином через випаровування та окислення. Навіть без додавання бульбашок сульфід у маточному розчині швидко втрачається через випаровування H2S11. Дослідження показали, що під час процесу розведення, який триває близько 30–60 секунд, близько 5–10% H2S втрачається через випаровування6. Щоб запобігти випаровуванню H2S з розчину, дослідники вжили кількох заходів, включаючи обережне перемішування розчину12, покриття маточного розчину пластиковою плівкою6 та мінімізацію контакту розчину з повітрям, оскільки швидкість випаровування H2S залежить від поверхні розділу повітря-рідина.13 Спонтанне окислення H2S відбувається головним чином через іони перехідних металів, особливо тривалентного заліза, які є домішками у воді.13 Окислення H2S призводить до утворення полісульфідів (атоми сірки, пов'язані ковалентними зв'язками)11. Щоб уникнути його окислення, розчини, що містять H2S, готують у дезоксигенованих розчинниках44,45, а потім продувають аргоном або азотом протягом 20–30 хвилин для забезпечення дезоксигенації.11,12,37,44,45,46 Діетилентріамінпентаоцтова кислота (DTPA) є хелатором металів (10–4 М), який запобігає автоокисленню HS- в аеробних розчинах. За відсутності DTPA швидкість автоокислення HS- становить приблизно 50% протягом приблизно 3 годин при 25°C37,47. Крім того, оскільки окислення 1e-сульфіду каталізується ультрафіолетовим світлом, розчин слід зберігати на льоду та захищати від світла11.
Як показано на рисунку 5, NaHS дисоціює на Na+ та HS-6 при розчиненні у воді; ця дисоціація визначається pK1 реакції, яка залежить від температури: pK1 = 3,122 + 1132/T, де T коливається від 5 до 30°C та вимірюється в градусах Кельвіна (K), K = °C + 273,1548. HS- має високий pK2 (pK2 = 19), тому при pH < 96,49 S2- не утворюється або утворюється у дуже малих кількостях. Навпаки, HS- діє як основа та приймає H+ від молекули H2O, а H2O діє як кислота та перетворюється на H2S та OH-.
Утворення розчиненого газоподібного H2S у розчині NaHS (30 мкМ). aq – водний розчин; g – газ; l – рідина. Усі розрахунки взяті за умови, що pH води = 7,0, а температура води = 20 °C. Створено за допомогою BioRender.com.
Незважаючи на докази нестабільності розчинів NaHS, у кількох дослідженнях на тваринах розчини NaHS використовувалися у питній воді як донор H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 з тривалістю втручання від 1 до 21 тижня (Таблиця 2). Під час цих досліджень розчин NaHS оновлювався кожні 12 год, 15, 17, 18, 24, 25 год або 24 год, 19, 20, 21, 22, 23 год. Наші результати показали, що щури піддавалися впливу нестабільних концентрацій препарату через втрату H2S з розчину NaHS, а вміст NaHS у питній воді щурів значно коливався протягом 12 або 24 год (див. Рисунок 2). Два з цих досліджень повідомляли, що рівень H2S у воді залишався стабільним протягом 24 годин22 або що протягом 12 годин15 спостерігалися втрати H2S лише на 2–3%, але вони не надали підтверджуючих даних чи деталей вимірювань. Два дослідження показали, що малий діаметр пляшок для води може мінімізувати випаровування H2S15,19. Однак наші результати показали, що це може затримати втрату H2S з пляшки для води лише на 2 години, а не на 12–24 години. В обох дослідженнях зазначається, що ми припускаємо, що рівень NaHS у питній воді не змінився, оскільки ми не спостерігали зміни кольору води; отже, окислення H2S повітрям було незначним19,20. Дивно, але цей суб'єктивний метод оцінює стабільність NaHS у воді, а не вимірює зміну його концентрації з часом.
Втрата H2S у розчині NaHS пов'язана з pH та температурою. Як зазначалося в нашому дослідженні, розчинення NaHS у воді призводить до утворення лужного розчину50. Коли NaHS розчиняється у воді, утворення розчиненого газоподібного H2S залежить від значення pH6. Чим нижчий pH розчину, тим більша частка NaHS присутня у вигляді молекул газоподібного H2S і тим більше сульфіду втрачається з водного розчину11. У жодному з цих досліджень не повідомлялося про pH питної води, що використовується як розчинник для NaHS. Згідно з рекомендаціями ВООЗ, які прийняті більшістю країн, pH питної води повинен бути в діапазоні 6,5–8,551. У цьому діапазоні pH швидкість спонтанного окислення H2S зростає приблизно в десять разів13. Розчинення NaHS у воді в цьому діапазоні pH призведе до концентрації розчиненого газоподібного H2S від 1 до 22,5 мкМ, що підкреслює важливість контролю pH води перед розчиненням NaHS. Крім того, діапазон температур, зазначений у вищезгаданому дослідженні (18–26 °C), призвів би до зміни концентрації розчиненого газоподібного H2S у розчині приблизно на 10%, оскільки зміни температури змінюють pK1, а невеликі зміни pK1 можуть суттєво впливати на концентрацію розчиненого газоподібного H2S48. Крім того, тривала тривалість деяких досліджень (5 місяців)22, протягом яких очікується велика мінливість температури, також загострює цю проблему.
У всіх дослідженнях, окрім одного21, використовувався розчин NaHS з концентрацією 30 мкМ у питній воді. Щоб пояснити використану дозу (тобто 30 мкМ), деякі автори зазначили, що NaHS у водній фазі утворює точно таку ж концентрацію газоподібного H2S, і що фізіологічний діапазон H2S становить від 10 до 100 мкМ, тому ця доза знаходиться в межах фізіологічного діапазону15,16. Інші пояснили, що 30 мкМ NaHS може підтримувати рівень H2S у плазмі у фізіологічному діапазоні, тобто 5–300 мкМ19,20. Ми розглядаємо концентрацію NaHS у воді 30 мкМ (pH = 7,0, T = 20 °C), яка використовувалася в деяких дослідженнях для вивчення впливу H2S. Ми можемо розрахувати, що концентрація розчиненого газоподібного H2S становить 14,7 мкМ, що становить приблизно 50% від початкової концентрації NaHS. Це значення подібне до значення, розрахованого іншими авторами за тих самих умов13,48.
У нашому дослідженні введення NaHS не змінило масу тіла; цей результат узгоджується з результатами інших досліджень на самцях мишей22,23 та самцях щурів18; Однак, два дослідження повідомляли, що NaSH відновлював знижену масу тіла у щурів після нефректомії24,26, тоді як інші дослідження не повідомляли про вплив введення NaSH на масу тіла15,16,17,19,20,21,25. Крім того, в нашому дослідженні введення NaSH не впливало на рівень сечовини та креатиніну-хрому в сироватці крові, що узгоджується з результатами іншого дослідження25.
Дослідження показало, що додавання NaHS до питної води протягом 2 тижнів не вплинуло на загальну концентрацію сульфіду в сироватці крові самців та самок щурів. Цей висновок узгоджується з результатами Sen et al. (16): 8 тижнів лікування 30 мкМ NaHS у питній воді не вплинуло на рівень сульфіду в плазмі крові контрольних щурів; однак вони повідомили, що це втручання відновило знижений рівень H2S у плазмі нефректомованих мишей. Li et al. (22) також повідомили, що лікування 30 мкМ NaHS у питній воді протягом 5 місяців збільшило рівень вільного сульфіду в плазмі крові старих мишей приблизно на 26%. В інших дослідженнях не повідомлялося про зміни в циркулюючому сульфіді після додавання NaHS до питної води.
У семи дослідженнях повідомлялося про використання Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, але не було надано додаткової інформації про гідратну воду, а в п'яти дослідженнях не згадувалося джерело NaHS, що використовувався в їхніх методах отримання17,18,24,25,26. NaHS є гідратованою молекулою, і вміст її гідратної води може змінюватися, що впливає на кількість NaHS, необхідної для приготування розчину заданої молярності. Наприклад, вміст NaHS у нашому дослідженні становив NaHS•1,3 H2O. Таким чином, фактичні концентрації NaHS у цих дослідженнях можуть бути нижчими за зазначені.
«Як така короткочасна сполука може мати такий тривалий ефект?» — поставили це питання Позгей та ін.21, оцінюючи вплив NaHS на коліт у мишей. Вони сподіваються, що майбутні дослідження зможуть відповісти на це питання, і припускають, що розчини NaHS можуть містити більш стабільні полісульфіди на додаток до H2S та дисульфідів, які опосередковують ефект NaHS21. Інша можливість полягає в тому, що дуже низькі концентрації NaHS, що залишаються в розчині, також можуть мати корисний ефект. Фактично, Олсон та ін. надали докази того, що мікромолярні рівні H2S у крові не є фізіологічними та повинні бути в наномолярному діапазоні або взагалі бути відсутніми13. H2S може діяти через сульфатування білків, оборотну посттрансляційну модифікацію, яка впливає на функцію, стабільність та локалізацію багатьох білків52,53,54. Фактично, за фізіологічних умов приблизно від 10% до 25% багатьох білків печінки сульфільовані53. Обидва дослідження визнають швидке руйнування NaHS19,23, але несподівано стверджують, що «ми контролювали концентрацію NaHS у питній воді, щодня замінюючи його».23 В одному дослідженні випадково було зазначено, що «NaHS є стандартним донором H2S і зазвичай використовується в клінічній практиці для заміни самого H2S».18
Наведене вище обговорення показує, що NaHS втрачається з розчину внаслідок випаровування, окислення та фотолізу, і тому пропонуються деякі пропозиції щодо зменшення втрат H2S з розчину. По-перше, випаровування H2S залежить від межі розділу газ-рідина13 та pH розчину11; тому, щоб мінімізувати втрати на випаровування, шийку пляшки для води можна зробити якомога меншою, як описано раніше15,19, а pH води можна регулювати до прийнятної верхньої межі (тобто 6,5–8,551), щоб мінімізувати втрати на випаровування11. По-друге, спонтанне окислення H2S відбувається через вплив кисню та наявність іонів перехідних металів у питній воді13, тому дезоксигенація питної води аргоном або азотом44,45 та використання хелаторів металів37,47 можуть зменшити окислення сульфідів. По-третє, щоб запобігти фоторозкладу H2S, пляшки для води можна обгортати алюмінієвою фольгою; Ця практика також стосується світлочутливих матеріалів, таких як стрептозотоцин55. Зрештою, неорганічні сульфідні солі (NaHS, Na2S та CaS) можна вводити через зонд, а не розчиняти їх у питній воді, як повідомлялося раніше56,57,58; дослідження показали, що радіоактивний сульфід натрію, що вводиться щурам через зонд, добре абсорбується та розподіляється практично по всіх тканинах59. На сьогоднішній день у більшості досліджень неорганічні сульфідні солі вводили внутрішньочеревно; однак цей шлях рідко використовується в клінічних умовах60. З іншого боку, пероральний шлях є найпоширенішим і найбажанішим шляхом введення у людей61. Тому ми рекомендуємо оцінювати вплив донорів H2S на гризунів шляхом перорального введення через зонд.
Обмеженням є те, що ми вимірювали сульфід у водному розчині та сироватці крові за допомогою методу MB. Методи вимірювання сульфіду включають титрування йодом, спектрофотометрію, електрохімічний метод (потенціометрія, амперометрія, кулонометричний метод та амперометричний метод) та хроматографію (газова хроматографія та високоефективна рідинна хроматографія), серед яких найпоширенішим методом є спектрофотометричний метод MB62. Обмеженням методу MB для вимірювання H2S у біологічних зразках є те, що він вимірює всі сірковмісні сполуки, а не вільний H2S63, оскільки він виконується в кислих умовах, що призводить до екстракції сірки з біологічного джерела64. Однак, за даними Американської асоціації громадського здоров'я, MB є стандартним методом вимірювання сульфіду у воді65. Тому це обмеження не впливає на наші основні результати щодо нестабільності розчинів, що містять NaHS. Крім того, в нашому дослідженні відновлення вимірювань сульфіду у зразках води та сироватки, що містять NaHS, становило 91% та 93% відповідно. Ці значення відповідають раніше повідомленим діапазонам (77–92)66, що вказує на прийнятну аналітичну точність42. Варто зазначити, що ми використовували як самців, так і самок щурів відповідно до рекомендацій Національних інститутів охорони здоров'я (NIH), щоб уникнути надмірної залежності від досліджень на тваринах лише на самцях у доклінічних дослідженнях67 та включати як самців, так і самок щурів, коли це можливо68. Цей момент був підкреслений іншими69,70,71.
На завершення, результати цього дослідження показують, що розчини NaHS, приготовані з питної води, не можуть бути використані для отримання H2S через їхню нестабільність. Такий шлях введення піддасть тварин нестабільним та нижчим за очікуваний рівням NaHS; тому отримані результати можуть бути не застосовними до людей.
Набори даних, використані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора за обґрунтованим запитом.
Сабо, К. Хронологія досліджень сірководню (H2S): від екологічного токсину до біологічного медіатора. Біохімія та фармакологія 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Абе, К. та Кімура, Х. Можлива роль сірководню як ендогенного нейромодулятора. Журнал нейронауки, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Чіріно, Г., Сабо, К. та Папапетропулос, А. Фізіологічна роль сірководню в клітинах, тканинах та органах ссавців. Огляди у фізіології та молекулярній біології 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Діллон, К.М., Карраццоне, Р.Дж., Матсон, Дж.Б. та Кашфі, К. Перспективи клітинних систем доставки оксиду азоту та сірководню, що розвиваються: нова ера персоналізованої медицини. Біохімія та фармакологія 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. та ін. Тривале введення донора сірководню з повільним вивільненням може запобігти ішемії/реперфузійному пошкодженню міокарда. Наукові звіти 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Сітдікова, Г.Ф., Фукс, Р., Кайнц, В., Вайгер, Т.М. та Германн, А. Фосфорилювання BK-каналу регулює чутливість до сірководню (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Сітдікова, Г.Ф., Вайгер, Т.М. та Германн, А. Сірководень посилює активність кальцій-активованих калієвих (BK) каналів у пухлинних клітинах гіпофіза щурів. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Джедді, С. та ін. Сірководень посилює захисний ефект нітриту проти ішемії-реперфузійного пошкодження міокарда у щурів з діабетом 2 типу. Оксид азоту 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Корвіно, А. та ін. Тенденції в хімії донорів H2S та її вплив на серцево-судинні захворювання. Антиоксиданти 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
ДеЛеон, Е.Р., Стой, Г.Ф. та Олсон, К.Р. (2012). Пасивні втрати сірководню в біологічних експериментах. Аналітична біохімія 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Надь, П. та ін. Хімічні аспекти вимірювань сірководню у фізіологічних зразках. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Клайн, доктор права. Спектрофотометричне визначення сірководню в природних водах. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Олсон, К. Р. (2012). Практичне навчання з хімії та біології сірководню. «Антиоксиданти». Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).