Сортування білків у секреторному шляху є важливим для підтримки компартменталізації клітин та гомеостазу. Окрім сортування, опосередкованого оболонкою, роль ліпідів у сортуванні кінезинів у процесі секреторного транспорту є давнім фундаментальним питанням, на яке ще немає відповіді. Тут ми виконуємо 3D-одночасну багатокольорову візуалізацію високої роздільної здатності в реальному часі, щоб довести in vivo, що нещодавно синтезовані білки, іммобілізовані глікозилфосфатидилінозитолом, з дуже довгими ліпідними фрагментами кераміду кластеруються та класифікуються у спеціалізовані сайти виходу ендоплазматичної мережі, які відрізняються від тих, що використовуються трансмембранними білками. Крім того, ми показуємо, що довжина ланцюга кераміду в мембрані ендоплазматичного ретикулуму є критичною для селективності цього сортування. Наше дослідження надає перші прямі докази in vivo для класифікації білкових вантажів на основі довжини ліпідного ланцюга на селективні сайти експорту в секреторному шляху.
В еукаріотичних клітинах білки, синтезовані в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР), потім сортуються під час транспортування секреторним шляхом для доставки до відповідного клітинного пункту призначення (1). Окрім сортування, опосередкованого оболонкою, довго припускалося, що певні ліпіди також можуть служити селективними точками виходу, кластеризуючи їх у специфічні мембранні домени, що відповідають за певні білки (2-5). Однак досі бракує прямих доказів in vivo, які б доводили цей можливий механізм, що базується на ліпідах. Щоб вирішити цю основну проблему, ми вивчали на дріжджах, як білки, закріплені глікозилфосфатидилінозитолом (GPI), (GPI-APs), диференційно експортуються з ЕР. GPI-APs – це різноманітні ліпідно-пов'язані білки клітинної поверхні (6, 7). GPI-AP – це секретований білок, прикріплений до зовнішніх листків плазматичної мембрани через гліколіпідний фрагмент (GPI-якір). Вони приймають GPI-якіри як консервативні посттрансляційні модифікації в просвіті ЕР (8). Після прикріплення GPI-AP проходить через апарат Гольджі (5, 9) з ЕР до плазматичної мембрани. Наявність GPI-якорів призводить до того, що GPI-AP транспортується окремо від трансмембранних секретованих білків (включаючи інші білки плазматичної мембрани) вздовж секреторного шляху (5, 9, 10). У клітинах дріжджів GPI-AP відокремлюються від інших секретованих білків в ендоплазматичному ретикулумі, а потім упаковуються в унікальні везикули, обгорнуті комплексом білків оболонки II (COPII) (6, 7). Детермінанти цього процесу класифікації в процесі експорту ЕР незрозумілі, але припускається, що цей механізм може вимагати ліпідів, особливо структурне ремоделювання ліпідної частини GPI-якоря (5, 8). У дріжджах ремоделювання ліпідів GPI починається одразу після прикріплення GPI, і в багатьох випадках це призводить до зв'язування цераміду з 26-вуглецевою довголанцюговою насиченою жирною кислотою (C26:0) (11, 12). C26 церамід є основним церамідом, що виробляється дріжджовими клітинами досі. Він синтезується в ЕР, і більша його частина експортується до апарату Гольджі через везикули COPII (13). Експорт GPI-AP з ЕР вимагає постійного синтезу цераміду (14, 15), і, своєю чергою, перетворення цераміду на інозитолфосфат-церамід (IPC) в апараті Гольджі залежить від синтезу GPI-якоря (16). Біофізичні дослідження зі штучними мембранами показали, що дуже довгі цераміди з ацильним ланцюгом можуть об'єднуватися, утворюючи впорядковані домени з унікальними фізичними властивостями (17, 18). Ці дані призводять до гіпотези, що церамід C26 та GPI-AP з церамідом C26 використовують свої фізичні властивості для об'єднання в упорядковані області або області у відносно неохайному ліпідному середовищі мембрани ЕР. Воно в основному складається з коротких і ненасичених гліцероліпідів (C16:1 та C18:1) (19, 20). Ці області будуть вибірково зосереджені на певних сайтах виходу з ендоплазматического ретикулуму (ERES), звідки церамід та GPI-AP на основі цераміду можуть бути спільно транспортовані до апарату Гольджі в одному й тому ж спеціальному везикулі COPII (5).
У цьому дослідженні ми безпосередньо протестували цей ліпідний механізм за допомогою конфокальної мікроскопії зображення в реальному часі з надвисокою роздільною здатністю (SCLIM), яка є передовою технікою мікроскопії, що дозволяє одночасно спостерігати флуоресцентно мічені білки. Триколірні та тривимірні (3D) зображення мають надзвичайно високу роздільну здатність та швидкість у живих клітинах (21, 22).
Спочатку ми застосували технологію SCLIM, щоб краще визначити, як нормальний GPI-AP з церамідною групою C26 був відокремлений від трансмембранних білків, що секретуються після виходу з ЕР у S. cerevisiae. Щоб перевірити класифікацію ЕР, ми використовували генетичну систему, яка може безпосередньо візуалізувати щойно синтезований вантаж, що потрапляє в ERES in vivo (7, 23). Як вантаж ми обрали GPI-AP Gas1 на основі цераміду C26, мічений зеленим флуоресцентним білком (GFP), та трансмембранний секретований білок Mid2, мічений ближнім інфрачервоним флуоресцентним білком (iRFP), обидва з яких націлені на плазматичну мембрану (24–26). У температурно-чутливому мутанті sec31-1 ці два вантажі експресуються під дією галактозо-індукованого промотора та конститутивного маркера ERES. За екстремальної температури (37°C), оскільки мутація sec31-1 впливає на функцію компонента оболонки COPII Sec31, який пригнічує проростання COPII та експорт ЕР, щойно синтезований вантаж накопичується в ЕР (23). Після охолодження до низької температури (24°C) мутантні клітини sec31-1 відновилися з секреторної зони, і накопичений новий синтетичний вантаж почав експортуватися з ЕР. Візуалізація CLIM показала, що більша частина щойно синтезованих Gas1-GFP та Mid2-iRFP все ще накопичувалася в ЕР мутантних клітин sec31-1 після інкубації при 37°C, а потім вивільнялася при 24°C протягом 5 хвилин (Рисунок 1). Оскільки Mid2-iRFP розподілений по всій мембрані ЕР, а Gas1-GFP концентрується та збирається в переривчастій області мембрани ЕР, їх розподіл зовсім інший (Рисунок 1, A-C та відео S1). Крім того, як показано на Рисунку 1D, кластер Gas1-GFP не має Mid2-iRFP. Ці результати вказують на те, що GPI-AP та трансмембранні білки були розділені на різні області мембрани ЕР на ранній стадії. Кластер Gas1-GFP розташований поруч зі специфічним ERES, міченим білком оболонки mCherry COPII Sec13 (Рисунок 1, E та F, і відео S1) (23).
Клітини sec31-1 експресують індуковані галактозою секрети, керамід GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, зелений) з довгим ацильним ланцюгом (C26) та трансмембранний білок Mid2-iRFP (TMP, синій), і це конструктивне мічення ERES Sec13-mCherry (ERES, пурпуровий) інкубували при 37°C протягом 30 хвилин, перенесли до 24°C та візуалізували за допомогою SCLIM через 5 хвилин. (A-C) показує репрезентативне об'єднане або одинарне 2D-зображення площини (A), 2D-проекційне зображення 10 z-зрізів (B) або 3D-зображення півкулі клітини вантажу та маркерів ERES (C). Масштабна шкала 1 мкм (A та B). Одиниця масштабу - 0,551 мкм (C). Gas1-GFP був виявлений в окремих областях або кластерах ER, тоді як Mid2-iRFP був виявлений та розподілений по всій мембрані ER (C). (D) Графік показує відносну інтенсивність флуоресценції Gas1-GFP та Mid2-iRFP у кластері Gas1-GFP вздовж лінії білої стрілки (ліворуч). AU – довільна одиниця. (E та F) представляють 3D-зображення, що поєднує goods та позначку ERES. Кластери Gas1-GFP були виявлені поблизу конкретного ERES. Одиниця масштабу – 0,551 мкм. (F) Біла суцільна стрілка позначає кластер Gas1-GFP, пов'язаний з ERES. Середня та права панелі показують об'єднане збільшене 3D-зображення та повернутий вигляд вибраного кластера Gas1-GFP.
Тісний просторовий зв'язок між кластером Gas1-GFP та специфічним ERES вказує на те, що Gas1-GFP може входити в селективний ERES, що відрізняється від селективності, яку використовує Mid2-iRFP для виходу з ER. Щоб розглянути цю можливість, ми кількісно визначили співвідношення ERES лише для одного або двох товарів (Рисунок 2, від A до C). Ми виявили, що більшість ERES (70%) містять лише один тип вантажу. Нижнє зображення Рисунка 2C показує два типові приклади ERES лише з Gas1-GFP (Рисунок 1) або лише з Mid2-iRFP (Рисунок 2). На противагу цьому, приблизно 20% ERES містять два вантажі, які перекриваються в одній області. Було виявлено, що деякі ERES (10%) містили два типи вантажу, але вони були ізольовані в чітко різних областях. Таким чином, цей статистичний аналіз показує, що після експорту ER, GPI-AP Gas1-GFP та трансмембранний вантаж Mid2-iRFP поділяються на різні ERES (Рисунок 2D). Ця ефективність сортування дуже узгоджується з попереднім біохімічним аналізом (6) та морфологічним визначенням (7). Ми також можемо спостерігати за поведінкою карантинного вантажу, що потрапляє в ERES (Рисунок 2E та Фільм S2). На Рисунку 2E видно, що лише невелика частина Gas1-GFP (панель 3) або Mid2-iRFP (панель 4) потрапляє в ERES з одного боку та обмежена окремою областю. На Панелі 5 Рисунку 2E видно, що Gas1-GFP та Mid2-iRFP іноді знаходяться в одному ERES, але вони потрапляють з різних боків та зосереджені в окремих регіонах, які можуть представляти різні везикули COPII. Ми також підтвердили, що спостережуване розділення та класифікація GPI-AP Gas1 на основі кераміду C26 як селективного ERES є специфічним, оскільки інший трансмембранний секреторний вантаж, GFP-мічений білок плазматичної мембрани Axl2 (27), демонструє подібну поведінку до Mid2-iRFP. (Рисунок S1 та Фільм S3). Новосинтезований Axl2-GFP розподіляється через мембрану ER, подібно до Mid2-iRFP (рисунки S1, A та B), і колокалізується з Mid2-iRFP у більшості ERES (рисунки S1, B-D). На панелях 1 та 2 рисунка 1. S1C показано два типові приклади ERES, де два трансмембранні вантажі перекриваються. У цих випадках обидва вантажі потрапляють в ERES разом (рисунок S1E, панель 3 та фільм S3).
Клітини sec31-1, що експресують галактозоіндуковану секрецію, Gas1-GFP (GPI-AP, зелений) та Mid2-iRFP (TMP, синій), а також конститутивне мічення ERES Sec13-mCherry (ERES, пурпуровий), поміщали при 37°C. Після 30-хвилинної інкубації при температурі 37°C переміщували до 24°C для вивільнення блоку секреції та через 20 хвилин проводили зображення за допомогою SCLIM. (A-C) Репрезентативні 2D-проекційні зображення (A; масштабна шкала, 1 мкм) або 3D-зображення півкуль клітин (B та C; одиниця масштабу, 0,456 мкм) вантажу та 10 z-зрізів, позначених ERES. Нижня панель у (B) та панель у (C) відображають оброблені зображення для відображення лише товарів, присутніх в ERES (пурпуровий) [Gas1-GFP (сірий) та Mid2-iRFP (світло-блакитний)]. (C) Відкрита стрілка: ERES містить лише один шматок вантажу (від 1 до 4). Сіра стрілка: ERES містить сегрегований вантаж (5). Біла суцільна стрілка: ERES містить спільно розташований вантаж. Нижче: Вибраний окремий ERES містить лише Gas1-GFP (1) або Mid2-iRFP (2). Масштабна шкала, 100 нм. (D) Кількісна оцінка фотомікрографії, описаної в (C). Середній відсоток ERES, що містить лише один вантаж (Gas1-GFP або Mid2-iRFP), сегрегований вантаж та вантаж, що перекривається. У трьох незалежних експериментах n=432 у 54 клітинках. Шкала похибки = SD. Двосторонній непарний t-тест. *** P = 0,0002. (E) 3D-зображення вибраних ERES карантинного вантажу, позначеного (C). Gas1-GFP (зелений) (3) або Mid2-iRFP (синій) (4) потрапляє в ERES (пурпуровий) з одного боку та обмежений невеликою ділянкою в межах ERES. Іноді обидва типи вантажу потрапляють в один і той самий ERES (5) з одного боку та обмежені ізольованою ділянкою в межах ERES. Масштабна шкала, 100 нм.
Далі ми перевірили гіпотезу про те, що довгий ацильний ланцюговий керамід (C26), присутній у мембрані ЕР, призводить до специфічної кластеризації та сортування Gas1 у селективні ERES. Для цього ми використали модифікований штам дріжджів GhLag1, в якому дві ендогенні керамідсинтази Lag1 та Lac1 були замінені на GhLag1 (гомолог Lag1 бавовни), що призвело до отримання штаму дріжджів із керамідом клітинної мембрани, коротшим за дикий тип (Рисунок 3A) (28). Аналіз мас-спектрометрії (MS) показав, що у штамах дикого типу 95% загального кераміду є дуже довгим (C26) ланцюговим керамідом, тоді як у GhLag1 85% кераміду є дуже довгим (C18 та C16) , лише 2% кераміду є дуже довгим (C26) ланцюговим керамідом. Хоча основними церамідами, виявленими в мембрані GhLag1 на сьогодні, є цераміди C18 та C16, мас-спектрометрія також підтвердила, що якір GPI Gas1-GFP, експресований у штамі GhLag1, містить церамід C26, який можна порівняти з ліпідами дикого типу. Якість однакова (рис. 3A) (26). Отже, це означає, що фермент ремоделювання цераміду Cwh43 є високоселективним до цераміду C26, як показано на рисунку 26, він переважно включає якір GPI з невеликої кількості цераміду C26 у штамі GhLag1. S2 (29). Тим не менш, клітинна мембрана GhLag1 в основному містить лише церамід C18-C16, тоді як Gas1-GFP все ще містить церамід C26. Цей факт робить цей штам ідеальним інструментом для цілеспрямованого вирішення проблеми довжини ацильного ланцюга мембранного цераміду в ЕР. Гіпотетична роль класу та сортування. Потім ми спочатку дослідили здатність C26 Gas1-GFP накопичуватися в кластерах в GhLag1 з температурно-чутливим мутантним алелем sec31-1 за допомогою звичайної флуоресцентної мікроскопії, де в кераміді мембрани ЕР існує лише довгий (C18-C16) ланцюг (рис. 3). Ми спостерігали, що в sec31-1 більша частина Gas1-GFP була зосереджена в кластерах, тоді як Gas1-GFP в sec31-1 GhLag1 з довгою (C18-C16) керамідною мембраною ЕР переважно не був кластеризований і розподілений по всій мембрані ЕР. Якщо бути точним, оскільки кластеризація на основі кераміду C26 тісно пов'язана зі специфічним ERES (рис. 1), ми далі дослідили, чи може цей процес також включати функцію механізму експортного білка ЕР. GPI-AP використовує спеціальну систему COPII для експорту ЕР, яка активно регулюється структурним ремоделюванням гліканової частини якоря GPI, здійсненим Ted1 (30, 31). Рекомбінантний GPI-глікан потім розпізнається трансмембранним комплексом вантажного рецептора p24, який, у свою чергу, селективно рекрутує Lst1, що є специфічною ізоформою основної вантажозв'язуючої субодиниці COPII Sec24, утворюючи багатий на GPI-AP везикули COPII (31-33). Тому ми сконструювали подвійний мутант, який поєднав делецію цих окремих білків (компонент комплексу p24 Emp24, фермент ремоделювання GPI-глікану Ted1 та специфічна субодиниця COPII Lst1) з мутантним штамом sec31-1, та дослідили їх. Чи можливо утворення Gas1-кластерного GFP (Рисунок 3). Ми спостерігали, що в sec31-1emp24Δ та sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP переважно некластеризований та розподілений по всій мембрані ER, як це було раніше помічено в sec31-1 GhLag1, тоді як у sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP подібний до sec31-1. Ці результати вказують на те, що, окрім присутності кераміду C26 у мембрані ЕР, кластеризація Gas1-GFP також повинна зв'язуватися з комплексом p24 і не вимагає специфічного рекрутування Lst1. Потім ми дослідили можливість того, що довжина ланцюга кераміду в мембрані ЕР може регулювати зв'язування Gas1-GFP з p24. Однак ми виявили, що присутність кераміду C18-C16 у мембрані не впливає на GPI-глікани, реконструйовані комплексом p24 (рисунки S3 та S4, A та B), або на зв'язування з GPI-AP та здатність експортувати GPI-AP. Рекрутує підтип COPII Lst1 (рисунок S4C). Отже, кластеризація, залежна від кераміду C26, не вимагає взаємодії білків з різними механізмами експорту білків ЕР, але підтримує альтернативний механізм сортування, зумовлений довжиною ліпідів. Потім ми проаналізували, чи є довжина ацильного ланцюга кераміду в мембрані ЕР важливою для ефективної класифікації Gas1-GFP як селективного ERES. Оскільки Gas1 у штамі GhLag1 з коротколанцюговим керамідом залишає ER та потрапляє в плазматичну мембрану (Рисунок S5), ми вважаємо, що якщо сортування зумовлене довжиною ацильного ланцюга кераміду, Gas1 у штамі GhLag1 може бути перенаправлений та схрещений. ERES-товари мають ту саму мембрану.
(A) Клітинна мембрана GhLag1 містить переважно коротші кераміди C18-C16, тоді як GPI-якорь Gas1-GFP все ще має той самий C26 IPC, що й клітини дикого типу. Вище: аналіз довжини ацильного ланцюга кераміду в клітинній мембрані штамів дикого типу (Wt) та GhLag1p за допомогою мас-спектрометрії (MS). Дані представляють відсоток від загального кераміду. Середнє значення трьох незалежних експериментів. Смуга похибки = SD. Двосторонній непарний t-тест. **** P <0,0001. Нижня панель: MS-аналіз довжини ацильного ланцюга IPC, присутнього в GPI-якорі Gas1-GFP (GPI-IPC), експресованому в штамах дикого типу та GhLag1p. Дані представляють відсоток від загального сигналу IPC. Середнє значення п'яти незалежних експериментів. Смуга похибки = SD. Двосторонній непарний t-тест. ns, неважливо. P = 0,9134. (B) Флуоресцентні мікрофотографії клітин sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ та sec31-1lst1Δ, що експресують галактозо-індукований Gas1-GFP, інкубували при 37°C протягом 30 хвилин та пропускали вниз для проведення рутинної флуоресцентної мікроскопії після 24°C. Біла стрілка: кластер Gas1-GFP ER. Відкрита стрілка: некластерний Gas1-GFP розподілений по всій мембрані ER, показуючи характерне для ER забарвлення ядерного кільця. Масштабна шкала, 5 мкм. (C) Кількісна оцінка фотомікрографії, описаної в (B). Середній відсоток клітин з точковою структурою Gas1-GFP. У трьох незалежних експериментах n ≥ 300 клітин. Шкала похибки = стандартне відхилення. Двосторонній непарний t-тест. **** P < 0,0001.
Щоб безпосередньо вирішити цю проблему, ми виконали SCLIM-візуалізацію Gas1-GFP та Mid2-iRFP в GhLag1 з температурно-чутливим мутантним алелем sec31-1 (Рисунок 4 та Фільм S4). Після того, як ER утримувався при 37°C та згодом вивільнявся при 24°C, більша частина щойно синтезованого Gas1-GFP не була кластеризована та розподілена по всій мембрані ER, як це спостерігалося за допомогою звичайних мікроскопів (Рисунок 4, A та B). Крім того, великий відсоток ERES (67%) включає два типи вантажу, розташованих разом у ньому (Рисунок 4D). Панелі 1 та 2 Рисунка 4C показують два типові приклади ERES з перекриттям Gas1-GFP та Mid2-GFP. Крім того, обидва вантажі були залучені до одного ERES (Рисунок 4E, панель 3 та фільм S4). Таким чином, наші результати показують, що довжина ацильного ланцюга кераміду в мембрані ER є важливим фактором, що визначає агрегацію та класифікацію білків ER.
Клітини Sec31-1 GhLag1, що експресують секрети, індуковані галактозою, Gas1-GFP (GPI-AP, зелений) та Mid2-iRFP (TMP, синій) та конститутивний ERES-мічений Sec13-mCherry (ERES, пурпуровий). Інкубувати при температурі 37°C. Продовжувати протягом 30 хвилин, знизити температуру до 24°C для вивільнення секретів та зробити знімок за допомогою SCLIM через 20 хвилин. (A-C) Репрезентативні 2D-проекційні зображення (A; масштабна шкала, 1 мкм) або 3D-зображення півкуль клітин (B та C; одиниця масштабу, 0,45 мкм) 10 z-зрізів, позначених вантажем та ERES. Нижня панель у (B) та панель у (C) відображають оброблені зображення для відображення лише товарів, присутніх в ERES (пурпуровий) [Gas1-GFP (сірий) та Mid2-iRFP (світло-блакитний)]. (C) Біла заповнена стрілка: ERES, товари перекриваються. Відкрита стрілка: ERES містить лише один елемент. Нижня панель: Вибраний ERES має товари, що перекриваються (1 та 2), позначені у (C). Масштабна шкала, 100 нм. (D) Кількісна оцінка фотомікрографії, описаної у (C). В одиницях sec31-1 та sec31-1 GhLag1 включено лише один вантаж (Gas1-GFP або Mid2-iRFP), а також середній відсоток ERES для ізольованого вантажу та вантажу, що перекривається. У трьох незалежних експериментах n = 432 у 54 клітинах (sec31-1) та n = 430 у 47 клітинах (sec31-1 GhLag1). Шкала похибки = SD. Двосторонній непарний t-тест. *** P = 0,0002 (sec31-1) та ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-зображення вибраного ERES з вантажем, що перекривається (3), позначеним у (C). Gas1-GFP (зелений) та Mid2-iRFP (синій) наближаються до ERES (пурпуровий) з одного боку та залишаються в одній і тій самій обмеженій зоні ERES. Масштабна шкала, 100 нм.
Це дослідження надає прямі докази in vivo того, що білкові вантажі на основі ліпідів класифікуються за селективними сайтами експорту в секреторному шляху, та розкриває важливість довжини ацильного ланцюга для селективності класифікації. Використовуючи потужний та передовий метод мікроскопії під назвою SCLIM, ми продемонстрували нещодавно синтезований Gas1-GFP (основний GPI-AP плазматичної мембрани з дуже довгою ацильною ланцюговою (C26) ліпідною частиною цераміду) у дріжджах. Ділянки, кластеризовані в дискретних ER, пов'язані зі специфічними ERES, тоді як трансмембранні секретовані білки розподілені по всій мембрані ER (Рисунок 1). Крім того, ці два типи товарів вибірково потрапляють у різні ERES (Рисунок 2). Довжина ацильного ланцюга клітинного цераміду в мембрані зменшується з C26 до C18-C16, кластер Gas1-GFP порушується в дискретній області ER, а Gas1-GFP перенаправляється, щоб залишити ER з трансмембранним білком через той самий ERES (Рисунок 3 та Рисунок 3). 4).
Хоча GPI-AP використовує спеціалізований білковий механізм для виходу з ER, ми виявили, що розділення, залежне від цераміду C26, не залежить від диференціальних білкових взаємодій, які можуть призвести до спеціалізації ERES (рисунки S4 та S5). Натомість, наші результати підтверджують альтернативний механізм класифікації, зумовлений кластеризацією білків на основі ліпідів та подальшим виключенням інших вантажів. Наші спостереження показують, що в області або кластері Gas1-GFP, пов'язаному зі специфічним ERES, відсутній трансмембранний секретований білок Mid2-iRFP, що вказує на те, що церамід-залежний кластер GPI-AP C26 сприятиме їхньому потраплянню у відповідний ERES та водночас виключатиме трансмембранне потрапляння секретів у цей конкретний ERES (рисунки 1 та 2). Навпаки, присутність церамідів C18-C16 у мембрані ER не призводить до утворення областей або кластерів GPI-AP, тому вони не виключають і не замінюють трансмембранні секретовані білки в тому ж ERES (рисунки 3 та 4). Таким чином, ми припускаємо, що керамід C26 керує розділенням та класифікацією, сприяючи кластеризації білків, пов'язаних зі специфічними ERES.
Як досягти цієї кластеризації, залежної від кераміду C26, у певній області ЕР? Тенденція мембранного кераміду до латерального розділення може призвести до утворення GPI-AP та кераміду C26 невеликих та миттєво впорядкованих ліпідів у більш нерегулярному ліпідному середовищі мембрани ЕР, що містить коротші та ненасичені гліцериноліпіди. Якісні кластери (17, 18). Ці невеликі тимчасові кластери можуть бути додатково об'єднані у більші, стабільніші кластери після зв'язування з комплексом p24 (34). Відповідно до цього, ми показали, що C26 Gas1-GFP повинен взаємодіяти з комплексом p24 для утворення більших видимих ​​кластерів (Рисунок 3). Комплекс p24 - це гетерозиготний олігомер, що складається з чотирьох різних трансмембранних білків p24 у дріжджах (35), який забезпечує полівалентне зв'язування, що може призвести до зшивання невеликих кластерів GPI-AP, тим самим генеруючи більший стабільний кластер (34). Взаємодія між білковими ектодоменами GPI-AP також може сприяти їх агрегації, як показано під час їх транспорту Гольджі в поляризованих епітеліальних клітинах ссавців (36). Однак, коли керамід C18-C16 присутній у мембрані ЕР, коли комплекс p24 зв'язується з Gas1-GFP, великі окремі кластери не утворюються. Основний механізм може залежати від конкретних фізичних та хімічних властивостей кераміду з довгим ацильним ланцюгом. Біофізичні дослідження штучних мембран показують, що хоча як кераміди з довгим (C24), так і з коротким (C18-C16) ацильним ланцюгом можуть викликати розділення фаз, лише кераміди з довгим ацильним ланцюгом (C24) можуть сприяти високій кривизні та вигину плівки для зміни її форми. Завдяки взаємному порівнянню (17, 37, 38). Було показано, що трансмембранна спіраль TMED2, людського гомолога Emp24, вибірково взаємодіє зі сфінгомієліном на основі кераміду C18 у цитоплазматичних часточках (39). Використовуючи моделювання молекулярної динаміки (МД), ми виявили, що як кераміди C18, так і C26 накопичуються навколо цитоплазматичних часточок трансмембранної спіралі Emp24, і вони мають подібні переваги (Рисунок S6). Варто зазначити, що це вказує на те, що трансмембранна спіраль Emp24 може призводити до асиметричного розподілу ліпідів у мембрані. Це нещодавній результат, отриманий на основі клітин ссавців. Подібні МД-моделювання також показують наявність ефірних ліпідів (40). Тому ми припускаємо, що керамід C26 у двох часточках ER26 локально збагачений. Коли GPI-AP у просвітних часточках безпосередньо зв'язується з багатовалентним p24 та накопиченням кераміду C26 навколо p24 у цитоплазматичних часточках, це може сприяти супутній агрегації білків та викривленню мембрани, що генерується через пальці (41), що призводить до розділення GPI-AP на окремі області, що прилягають до ERES, що також сприяє сильно викривленим областям мембрани ER (42). Попередні звіти підтверджували запропонований механізм (43, 44). Багатовалентне зв'язування оліголектинів, патогенів або антитіл з глікосфінголіпідами на основі цераміду (GSL) на плазматичній мембрані запускає значну агрегацію GSL, посилює фазове розділення та викликає деформацію та інтерналізацію мембрани (44). Івабучі та ін. (43) Було виявлено, що за наявності довгих (C24), але не коротких (C16) ацильних ланцюгів, багатовалентний ліганд, зв'язаний з лактозилцерамідом GSL, індукує утворення великих кластерів та інвагінацію мембрани, а цитоплазма Lyn-опосередкованої передачі сигналу на листках переплітається ацильними ланцюгами у зв'язаних нейтрофілах.
У поляризованих епітеліальних клітинах ссавців концентрація анти-Гольджі мережі (TGN) до рівня апікальної плазматичної мембрани контролює розділення та сортування GPI-AP (10, 45). Ця агрегація зумовлена ​​олігомеризацією GPI-AP (36), але вона також може залежати від довжини церамідного ланцюга, який ми знаходимо у дріжджах. Хоча GPI-AP ссавців має якір на основі ефірного ліпіду, і його хімічна структура дуже відрізняється від дуже довгого ацильного ланцюга цераміду, нещодавнє дослідження показало, що обидва ліпіди мають еволюційно подібні фізичні та хімічні властивості та функцію (40). Отже, частина ефірного ліпіду в клітинах ссавців може бути подібною до C26 цераміду у дріжджах, і її роль полягає в зв'язуванні з довголанцюговим церамідом у мембрані для сприяння агрегації та сортуванню GPI-AP. Хоча цю можливість ще потрібно безпосередньо перевірити, попередні результати підтверджують, що транспортування довгого ацильного ланцюга цераміду до тільця Гольджі здійснюється не цитоплазматичними транспортними білками, а залежить від синтезу GPI-якорів, як у дріжджів. Отже, еволюційно консервативний механізм, здається, здатний вибірково котранспортувати церамід з дуже довгим ацильним ланцюгом та GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) в одному транспортному везикулі.
У системах поляризованих епітеліальних клітин дріжджів та ссавців агрегація та відділення GPI-AP від ​​інших білків плазматичної мембрани відбуваються до досягнення поверхні клітини. Паладіно та ін. (48) виявили, що на TGN поляризованих епітеліальних клітин ссавців кластеризація GPI-AP необхідна не лише для селективної класифікації GPI-AP на апікальній плазматичній мембрані, але й регулює організацію кластеризації GPI-AP та їх біологічну активність. Поверхня клітини. У дріжджах це дослідження показало, що керамід-залежний кластер GPI-AP C26 на ER може регулювати організацію кластерів та функціональну активність GPI-AP на плазматичній мембрані (24, 49). Відповідно до цієї моделі, клітини GhLag1 мають алергію на інгібітори GPI або препарати, що впливають на цілісність клітинної стінки (28), і потреба у функціональних кластерах Gas1-GFP (49) кінчикового кераміду, що проектується при спарюванні дріжджових клітин, вказує на G. Можливі фізіологічні наслідки клітин hLag1. Помилка GPI-AP. Однак, подальше тестування того, чи була функціональна організація клітинної поверхні запрограмована з ЕР методом сортування на основі довжини ліпідів, стане предметом наших майбутніх досліджень.
Штами Saccharomyces cerevisiae, використані в цій роботі, перелічені в таблиці S1. Штами MMY1583 та MMY1635 штаму SCLIM для візуалізації живих клітин були сконструйовані на тлі W303. Ці штами, що експресують Sec13-mCherry з флуоресцентною білковою міткою, були сконструйовані за допомогою методу на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з плазмідою pFA6a як матрицею (23). Штам, що експресує Mid2-iRFP, мічений флуоресцентним білком під контролем промотора GAL1, був сконструйований наступним чином. ПЛР-ампліфікація послідовності iRFP-KanMx з вектора pKTiRFP-KAN (дар Е. О'Ші, номер плазміди Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ідентифікатор дослідницького ресурсу (RRID): Addgene_64687) та вставка в C-кінець ендогенного Mid2. Після ампліфікації та клонування послідовності геному Mid2-iRFP у промотор GAL1, її інтегрували в сайт Not I-Sac I інтеграційної плазміди pRS306. Отриману плазміду pRGS7 лінеаризували за допомогою Pst I для інтеграції в локус URA3.
Ген злиття Gas1-GFP експресується під контролем промотора GAL1 у плазміді центромери (CEN), яка сконструйована наступним чином. Послідовність Gas1-GFP була ампліфікована за допомогою ПЛР з плазміди pRS416-GAS1-GFP (24) (дар від L. Popolo) та клонована в сайт Xma I–Xho I плазміди CEN pBEVY-GL LEU2 (дар від C). Miller; номер плазміди Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Отримана плазміда була названа pRGS6. Ген злиття Axl2-GFP також експресується під контролем промотора GAL1 вектора pBEVY-GL LEU2, і її конструкція така. Послідовність Axl2-GFP була ампліфікована з плазміди pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) за допомогою ПЛР та клонована в сайт Bam HI-Pst I вектора pBEVY-GL LEU2. Отримана плазміда була названа pRGS12. Послідовність олігонуклеотидів, використаних у цьому дослідженні, наведена в таблиці S2.
Штам доповнювали 0,2% аденіну та 2% глюкози [YP-декстроза (YPD)], 2% рафінозою [YP-рафіноза], багатим на дріжджовий екстракт білком p (YP) середовищем (1% дріжджового екстракту та 2% білка ept). (YPR)] або 2% галактозою [YP-галактоза (YPG)] як джерело вуглецю, або синтетичним мінімальним середовищем (0,15% азотистої основи дріжджів та 0,5% сульфату амонію) для доповнення відповідних амінокислот та основ, необхідних для живлення, та містили 2% глюкози (синтетичне глюкозне мінімальне середовище) або 2% галактози (синтетичне галактозне мінімальне середовище) як джерело вуглецю.
Для візуалізації в реальному часі температурно-чутливі мутантні клітини sec31-1, що експресують конструкцію під промотором GAL1, вирощували в середовищі YPR при 24°C протягом ночі до середини логарифмічної фази. Після індукції в YPG при 24°C протягом 1 години клітини інкубували в SG при 37°C протягом 30 хвилин, а потім переносили до 24°C для вивільнення з блоку секреції. Конканавалін А використовували для фіксації клітин на предметному склі та візуалізації за допомогою SCLIM. SCLIM – це комбінація інвертованого флуоресцентного мікроскопа Olympus IX-71 та масляної лінзи UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), високошвидкісного конфокального сканера з обертовим диском та високим співвідношенням сигнал/шум (Yokogawa Electric), спеціалізованого спектрометра та спеціального охолодження. Підсилювач зображення системи (Hamamatsu Photonics) може забезпечити систему збільшувальних лінз із кінцевим збільшенням ×266.7 та камеру із зарядовим зв'язком, яка множить електрони (Hamamatsu Photonics) (21). Отримання зображень виконується за допомогою спеціального програмного забезпечення (Yokogawa Electric). Для 3D-зображень ми використовували спеціально виготовлений п'єзоелектричний привід для вертикальної вібрації об'єктива та збирали оптичні частини на відстані 100 нм одна від одної в стек. Z-стекове зображення перетворюється на 3D воксельні дані, а теоретична функція розсіювання точок, що використовується для конфокального мікроскопа з обертовим диском, використовується для деконволюційної обробки за допомогою програмного забезпечення Volocity (PerkinElmer). За допомогою програмного забезпечення Volocity для автоматичного визначення порогу для аналізу колокації було виміряно ERES, включаючи вантаж. Аналіз лінійного сканування було виконано за допомогою програмного забезпечення MetaMorph (Molecular Devices).
Використовуйте програмне забезпечення GraphPad Prism для визначення статистичної значущості. Для двостороннього t-критерію Стьюдента та звичайного однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) відмінності між групами вважаються такими, що мають значний вплив на P <0,05 (*).
Для флуоресцентної мікроскопії Gas1-GFP клітини логарифмічної фази вирощували протягом ночі в YPD та збирали центрифугуванням, двічі промивали фосфатно-буферним фізіологічним розчином та інкубували на льоду протягом щонайменше 15 хвилин, а потім досліджували під мікроскопом, як описано раніше (24). Для збору даних використовували мікроскоп Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), оснащений об'єктивом, фільтром L5 (GFP), камерою Hamamatsu та програмним забезпеченням Application Suite X (LAS X).
Зразки денатурували буфером для зразків SDS при 65°C протягом 10 хвилин, а потім розділяли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі (PAGE). Для імуноблотінгового аналізу на кожну доріжку завантажували 10 мкл зразка. Первинні антитіла: використовували кролячі поліклональні антитіла проти Gas1 у розведенні 1:3000, кролячі поліклональні антитіла проти Emp24 у розведенні 1:500 та кролячі поліклональні антитіла проти GFP (подарунок від H. Riezman) у розведенні 1:3000. Мишаче моноклональне антитіло проти Pgk1 використовували у розведенні 1:5000 (подарунок від J. de la Cruz). Вторинні антитіла: кон'юговані з пероксидазою хрону (HRP) козячі антитіла проти кролячого імуноглобуліну G (IgG) у розведенні 1:3000 (Pierce). Кон'юговані з HRP козячі антитіла проти мишачого IgG використовували у розведенні 1:3000 (Pierce). Зону імунної відповіді спостерігали методом хемілюмінесценції з реагентом SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Як описано в (31), на збагаченій фракції ER було проведено експеримент з природною імунопреципітацією. Коротше кажучи, дріжджові клітини промивали буфером TNE [50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду та суміш інгібітора протеаз) при 600 нм (OD600) при оптичній щільності 100 двічі. Його розбивали скляними кульками, а потім клітинні залишки та скляні кульки видаляли центрифугуванням. Супернатант потім центрифугували при 17 000 g протягом 15 хвилин при 4°C. Осад ресуспендували в TNE та додавали сапонін наперстянки до кінцевої концентрації 1%. Суспензію інкубували протягом 1 години з обертанням при 4°C, а потім нерозчинні компоненти видаляли центрифугуванням при 13 000 g при 4°C протягом 60 хвилин. Для імунопреципітації Gas1-GFP спочатку попередньо інкубуйте зразок з порожніми агарозними кульками (ChromoTek) при 4°C протягом 1 години, а потім інкубуйте з GFP-Trap_A (ChromoTek) при 4°C протягом 3 годин. Імунопреципітовані кульки промивали п'ять разів TNE, що містить 0,2% дигоксигеніну, елюювали буфером для зразків SDS, розділяли на SDS-PAGE та аналізували за допомогою імуноблоттингу.
Як описано в (31), визначення зшивання проводили на збагаченій фракції ER. Коротко кажучи, збагачену фракцію ER інкубували з 0,5 мМ дитіобіс(сукцинімідилпропіонатом) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Іллінойс, США; 20°C, 20 хв). Реакцію зшивання зупиняли додаванням гліцину (кінцева концентрація 50 мМ, 5 хвилин, 20°C).
Як було описано раніше (50), було проведено МС-аналіз кераміду в штамах дикого типу та GhLag1. Коротше кажучи, клітини вирощували до експоненціальної фази (від 3 до 4 одиниць OD600/мл) у YPD при 30°C, і збирали 25×107 клітин. Їхній метаболізм зупиняли трихлороцтовою кислотою. Використовували екстракційний розчинник [етанол, вода, ефір, піридин та 4,2 N гідроксид амонію (15:15:5:1:0,018 об./об.)] та 1,2 нмоль внутрішнього стандарту кераміду C17 (860517, Avanti polar lipid) якості). Використовували монометиламіновий реагент [метанол, вода, н-бутанол та розчин метиламіну (4:3:1:5 об./об.)] для проведення м'якого лужного гідролізу екстракту, а потім використовували насичений водою н-бутанол для знесолення. Нарешті, екстракт ресуспендували в розчиннику позитивного режиму [хлороформ/метанол/вода (2:7:1) + 5 мМ ацетат амонію] та ввели в мас-спектрометр. Для ідентифікації та кількісного визначення молекул сфінголіпідів було проведено багатореакційний моніторинг (MRM). Третинний квадрупольний мас-спектрометр TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) оснащений роботизованим джерелом іонів нанопотоку Nanomate HD (Advion Biosciences, Ітака, Нью-Йорк) для аналізу ліпідів. Енергія зіткнення оптимізована для кожної категорії церамідів. Дані MS були отримані в позитивному режимі. Для кожної біологічної репліки ліпідний сигнал є медіаною трьох незалежних вимірювань.
Як описано в (31), клітини (800×107), що експресують Gas1-GFP, піддали природній імунопреципітації. Очищений Gas1-GFP розділили за допомогою SDS-PAGE та перенесли на мембрану з полівініліденфториду (PVDF). Білок візуалізували шляхом фарбування PVDF амідним чорним. Смугу Gas1-GFP вирізали з PVDF та промивали 5 разів метанолом і один раз водою, призначеною для рідинної хроматографії-MS (LC-MS). Інкубуючи мембранну смужку з 500 мкл 0,3 M NaOAc (pH 4,0), буфером та 500 мкл свіжорозчиненої 1 M суміші нітриту натрію при 37°C протягом 3 годин, ліпідна фракція вивільнялася з Gas1-GFP та лізувалася між глюкозаміном та інозитолом (51). Після цього мембранну смужку чотири рази промивали водою, призначеною для LC-MS, сушили при кімнатній температурі та зберігали в атмосфері азоту при -80°C до аналізу. Як контроль, для кожного експерименту використовували холостий зразок мембрани PVDF. Ліпід, екстрагований з Gas1-GFP, потім аналізували за допомогою мас-спектрометрії (MS), як описано (50). Коротше кажучи, смужки PVDF, що містять GPI-ліпід, ресуспендували в 75 мкл негативного розчинника для цвілі [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ ацетат амонію] та пропускали аналіз сфінголіпідів методом електророзпилювальної іонізації (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). У цьому випадку дані MS були отримані в режимі негативних іонів.
Як згадувалося раніше, ліпідну частину GPI-якоря було відокремлено від GPI-AP, міченого [3H]-інозитолом (16). Ліпіди розділили за допомогою тонкошарової хроматографії з використанням системи розчинників (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) та візуалізували за допомогою FLA-7000 (Fujifilm).
Клітини, що експресують Gas1-GFP (600×107), двічі промивали буфером TNE, розбивали скляними кульками та центрифугували для видалення клітинного дебриса та скляних кульок. Потім супернатант центрифугували при 17 000 g протягом 1 години при 4°C. Осад промивали в TNE та інкубували з 1 U PI-PLC (Invitrogen) у TNE, що містить 0,2% дигіталісного сапоніну, протягом 1 години при 37°C. Після обробки ферментами мембрану видаляли центрифугуванням при 17 000 g при 4°C протягом 1 години. Для імунопреципітації Gas1-GFP супернатант інкубували з GFP-Trap_A (ChromoTek) при 4°C протягом ночі. Очищений Gas1-GFP, розділений за допомогою SDS-PAGE, забарвлювали Кумасі блискучим синім. Смугу забарвлення Gas1-GFP відрізали від сірого кольору навколо акведука, а потім, після алкілування йодацетамідом та відновлення дитіотреїтолом, проводили гелеве розщеплення трипсином. Екстрагували та висушили триптичні пептиди та пептиди з GPI-гліканами. Висушений пептид розчиняли у 20 мкл води. Вводили порцію (8 мкл) у рідинний хроматограф. Для розділення пептидів у певних градієнтних умовах використовували колонку з октадецилсиланом (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; внутрішній діаметр 150 мм × 1,0 мм; Nomura Chemical, префектура Айчі, Японія). Рухома фаза – розчинник A (0,08% мурашина кислота) та розчинник B (0,15% мурашина кислота у 80% ацетонітрилі). Для елюювання колонки розчинником А протягом 55 хвилин при швидкості потоку 50 мкл/хв протягом 5 хвилин використовували систему ВЕРХ Accela (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс), а потім концентрацію розчинника B збільшували до 40%. Елюат безперервно вводили в джерело іонів ESI, а триптичні пептиди та пептиди з GPI-гліканами аналізували за допомогою LTQ Orbitrap XL (гібридний мас-спектрометр з лінійною іонною пасткою-орбітрапкою; Thermo Fisher Scientific). В установці MS напруга капілярного джерела була встановлена ​​на рівні 4,5 кВ, а температура переносного капіляра підтримувалася на рівні 300°C. Напруга на капілярі та напруга на трубці були встановлені на рівні 15 В та 50 В відповідно. Дані МС були отримані в режимі позитивних іонів (роздільна здатність 60 000; точність маси 10 частин на мільйон) у діапазоні мас 300/m/z зі співвідношенням маса/заряд (m/z) 3000. Дані МС/МС отримані через іонну пастку в LTQ Orbitrap XL [перші 3 цифри, від яких залежать дані, дисоціація, викликана зіткненням (CID)].
МД-моделювання було виконано за допомогою програмного забезпечення GROMACS (52) та силового поля MARTINI 2 (53-55). Потім для побудови бішару, що містить діолеоїлфосфатидилхолін (DOPC) та Cer C18 або DOPC та Cer C26, було використано програму CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57). Топологія та координати Cer C26 отримані з DXCE шляхом видалення зайвих кульок зі сфінгозинового хвоста. Використовуйте описаний нижче процес для балансування подвійного шару та його запуску, потім використовуйте останні координати системи для побудови системи, що містить Emp24. Трансмембранний домен дріжджів Emp24 (залишки 173-193) було побудовано як α-спіраль за допомогою інструменту візуальної МД (VMD) для молекулярної структури (58). Потім, після видалення перекриваючих ліпідів, білок був грубо гранульований та вставлений у бішар за допомогою CHARMM GUI. Кінцева система містить 1202 DOPC та 302 Cer C26 або 1197 DOPC та 295 Cer C18 та Emp24. Систему іонізують до концентрації 0,150 М. Було зроблено чотири незалежні повторності для двох двошарових композицій.
Ліпідний бішар балансується за допомогою процесу CHARMM GUI, який включає мінімізацію, а потім балансування 405 000 кроків, де обмеження положення поступово зменшуються та усуваються, а крок за часом збільшується з 0,005 пс до 0,02 пс. Після врівноваження він генерує 6 мкс з кроком за часом 0,02 пс. Після вставки Emp24 використовується той самий процес CHARMM GUI для мінімізації та балансування системи, а потім запускається протягом 8 секунд у робочому режимі.
Для всіх систем під час процесу балансування тиск контролюється баростатом Берендсена (59), а під час виробничого процесу тиск контролюється баростатом Паррінелло-Рахмана (60). У всіх випадках середній тиск становить 1 бар, і використовується напівізотропна схема зв'язку тиску. У процесі балансування та виробництва використовується термостат (61) з повторним калібруванням швидкості для зв'язку температури частинок білка, ліпідів та розчинника відповідно. Протягом усієї операції цільова температура становить 310 К. Взаємодія без утворення зв'язків розраховується шляхом створення списку пар за допомогою схеми Верле з буферним допуском 0,005. Кулонівський член розраховується з використанням поля реакції та граничної відстані 1,1 нм. Член Вандер-Ваальса використовує граничну схему з граничною відстанню 1,1 нм, а гранична схема Верле використовується для дрейфу потенціалу (62).
Використовуючи VMD, гранична довжина хвилі між фосфатними кульками DOPC або керамідними AM1 кульками та білком становить 0,7 нм, і розраховується кількість ліпідів, які взаємодіють з білком. За наступною формулою розраховується коефіцієнт виснаження-збагачення (DE), як у (63): DE-фактор = (кількість загальних ліпідів у білку 0,7) у білку 0,7 (кількість Cer у загальних ліпідах)
Зазначене значення отримано як середнє значення, а смуги похибок є чотирма незалежними копіями односторонньої помилки (SE). Статистична значущість фактора DE розраховується за допомогою t-критерію [(середнєDE-фактор-1)/SE]. Обчисліть значення P з одностороннього розподілу.
Для розрахунку 2D-карти латеральної щільності системи, що містить Emp24, протягом останніх 250 нс кривої було використано інструмент GROMACS. Щоб отримати карту збагачення/збіднення цераміду, карту щільності Cer ділять на суму карти Cer та DOPC, а потім ділять на концентрацію Cer в організмі. Використовується та сама шкала кольорової карти.
Додаткові матеріали до цієї статті див. за посиланням http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Це стаття з відкритим доступом, що розповсюджується відповідно до умов ліцензії Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, яка дозволяє використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії, за умови, що кінцеве використання не має комерційної вигоди, і передумова полягає в тому, що оригінальна робота є правильною. Посилання.
Примітка: Ми просимо вас надати свою адресу електронної пошти лише для того, щоб людина, яку ви рекомендуєте для сторінки, знала, що ви хочете, щоб вона побачила цей лист, і що це не спам. Ми не збиратимемо жодних адрес електронної пошти.
Це питання використовується для перевірки, чи ви відвідувач, та запобігання автоматичному надсиланню спаму.
Софія Родрігес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабідо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Alejandro Cortes-Gomez), Ацуко Ікеда (Atsuko Ikeda), Валерія Зоні (Валерія Зоні), Ауксіліадора Агілера-Ромеро, Ана Марія Перес -Лінеро), Серхіо Лопес (Серхіо) Лопес), Міхо Вага (Miho Waga), Місако Арман (Misako Arman), Міяко Ріман (Miyako Riman), Проу Акіра, Стефано Фанні, Акіхіко Накано, Мануель Муніс
3D-візуалізація високої роздільної здатності в реальному часі показує важливість довжини керамідного ланцюга для сортування білків у селективних вихідних сайтах.
Софія Родрігес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабідо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Alejandro Cortes-Gomez), Ацуко Ікеда (Atsuko Ikeda), Валерія Зоні (Валерія Зоні), Ауксіліадора Агілера-Ромеро, Ана Марія Перес -Лінеро), Серхіо Лопес (Серхіо) Лопес), Міхо Вага (Miho Waga), Місако Арман (Misako Arman), Міяко Ріман (Miyako Riman), Проу Акіра, Стефано Фанні, Акіхіко Накано, Мануель Муніс
3D-візуалізація високої роздільної здатності в реальному часі показує важливість довжини керамідного ланцюга для сортування білків у селективних вихідних сайтах.
©2020 Американська асоціація сприяння розвитку науки. всі права захищені. AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.