Javascript наразі вимкнено у вашому браузері. Деякі функції цього веб-сайту не працюватимуть, коли JavaScript вимкнено.
Зареєструйтесь, вказавши свої конкретні дані та конкретний препарат, який вас цікавить, і ми зіставимо надану вами інформацію зі статтями в нашій великій базі даних і негайно надішлемо вам копію електронною поштою у форматі PDF.
Гранули Ban-Lan-Gen послаблюють хронічний рецидивуючий коліт, викликаний декстраном сульфатом натрію, у мишей, модулюючи кишкову мікробіоту та відновлюючи продукцію кишкових SCFA, похідних від GLP-1.
Цзяо Пен,1-3,*Лі Сі,4,*Чжен Лінь,3,5 Дуань Ліфан,1 Гао Чженсянь,2,5 Дьєху,1 Лі Цзе,6 Лі Сяофен,6 Шень Сянчунь,5 Сяо Хайтао21Пекінський університет, Шеньчженська лікарня, кафедра фармації, Шеньчжень, Китайська Народна Республіка; 2Центр медичних наук Шеньчженського університету, Фармацевтична школа, Шеньчжень, Китайська Народна Республіка; 3Дослідницький центр інженерних технологій етнічної медицини та розвитку традиційної китайської медицини Гуйчжоуського медичного університету, Міністерство освіти, Гуйчжоуська ключова фармацевтична лабораторія, Гуйчжоуський медичний університет, Гуйян, Китайська Народна Республіка; 4Кафедра гастроентерології, Шеньчженська лікарня Пекінського університету, Шеньчжень, Китайська Народна Республіка; 5Фармацевтична школа, Гуйчжоуський медичний університет, Державна ключова лабораторія функцій та застосування лікарських рослин, Гуйян; 6 Кафедра лабораторної медицини, лікарня Пекінського університету Шеньчжень, Шеньчжень, Китай [email protected] Шень Сянчунь, фармацевтичний факультет, медичний університет Гуйчжоу, Гуйчжоу, Китайська Народна Республіка, 550004, електронна пошта [email protected] Мета: Терапія на основі GLP-1 є новим варіантом лікування запальних захворювань кишечника. Гранули Ban-Lan-Gen (BLG) – це відома противірусна препаративна форма ТКМ, яка проявляє потенційну протизапальну активність при лікуванні різних запальних станів. Однак її протизапальний ефект на коліт та механізм дії досі незрозумілі. МЕТОДИ: Встановити хронічний рецидивуючий коліт, індукований декстрансульфатом натрію (DSS), у мишей. Для оцінки захисного ефекту BLG проводили вимірювання індексів активності захворювання, гістологічних маркерів пошкодження та рівнів прозапальних цитокінів. Вплив BLG на кишкову мікробіоту та кишечник характеризувався рівнями GLP-1 у сироватці крові та експресією Gcg, GPR41 та GRP43 у товстій кишці, складом кишкової мікробіоти, рівнями SCFA у фекаліях та вивільненням GLP-1 з Первинні клітини товстої кишки мишей, що отримують продукцію GLP-1, отриману з SCFA. Результати: лікування BLG значно зменшило втрату маси тіла, DAI, скорочення товстої кишки, пошкодження тканин товстої кишки та рівні прозапальних цитокінів TNF-α, IL-1β та IL-6 у тканині товстої кишки. Крім того, лікування BLG може значно відновити експресію Gcg, GPR41 та GRP43 у товстій кишці та рівень GLP-1 у сироватці крові у мишей з колітом, збільшуючи кількість бактерій, що продукують SCFA, таких як Akkermansia та Prevotellaceae_UCG-001, та зменшуючи кількість бактерій, таких як Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas та Oscillibacter. Крім того, лікування BLG може значно підвищити рівень SCFA у калі мишей з колітом. Водночас, експерименти in vitro також показали, що екстракт фекалій мишей, оброблених BLG, може значно стимулювати секрецію GLP-1 первинними малими клітинами товстої кишки мишей. Висновки: Ці результати свідчать про те, що BLG має протиколітний ефект. BLG має потенціал для розробки як терапії, принаймні частково шляхом модуляції кишкової мікробіоти та відновлення продукції GLP-1, що походить від SCFA, у кишечнику. Перспективні препарати для лікування хронічного рецидивуючого коліту. Ключові слова: коліт, гранули Ban-Lan-Gen, кишкова мікробіота, коротколанцюгові жирні кислоти, GLP-1.
Виразковий коліт (ВК) – це тривале запальне захворювання товстої та прямої кишки, що характеризується рецидивуючою діареєю, болем у животі, втратою ваги та слизисто-гнійним кривавим стільцем.1 Останнім часом поширеність ВК зростає в країнах з раніше низьким рівнем захворюваності, включаючи Китай, зі зростанням популярності західного способу життя.2 Це зростання створює серйозні проблеми для громадського здоров'я та має серйозні наслідки для працездатності пацієнтів та якості життя. Примітно, що патогенез ВК залишається значною мірою неясним, але загальновизнано, що генетика, фактори навколишнього середовища, кишкова мікробіота та імунна система сприяють розвитку ВК.3 Навіть зараз не існує ліків від ВК, і метою лікування є клінічний контроль клінічних симптомів, індукція та підтримка ремісії, сприяння загоєнню слизової оболонки та зменшення рецидивів. Класичні методи лікування включають аміносаліцилати, кортикостероїди, імуносупресанти та біологічні препарати. Однак ці препарати не можуть досягти бажаного ефекту через різні побічні ефекти.4 Нещодавно багато тематичних досліджень показали, що традиційна китайська медицина (ТКМ) продемонструвала великий потенціал у полегшенні ВК. з низькою токсичністю, що свідчить про те, що розробка нових методів традиційної китайської медицини є перспективною стратегією лікування ВК.5-7
Гранули банлангена (BLG) – це препарат традиційної китайської медицини, виготовлений з водного екстракту кореня банлангена.8 Окрім противірусної ефективності, BLG проявляє потенційну протизапальну активність у лікуванні різних запальних станів.9,10 Крім того, з водних екстрактів Radix isatidis були виділені та ідентифіковані глюкозинолати (R,S-гойтрин, прогойтрин, епіпрорубін та глюкозид), нуклеозиди (гіпоксантин, аденозин, уридин та гуанозин) та алкалоїди індиго, такі як індиго та індирубін.11,12 Попередні дослідження добре задокументували, що сполуки аденозин, уридин та індирубін проявляють потужну протиколітну дію в різних тваринних моделях коліту.13-17 Однак не було проведено жодних досліджень, заснованих на доказах, для оцінки ефективності BLG при коліті. У цьому дослідженні ми досліджували захисний ефект BLG на хронічний рецидивуючий коліт, індукований декстрансульфатом натрію (DSS), у мишей C57BL/6, і виявили... що пероральне введення BLG значно послаблює індуковане DSS хронічне рецидивуюче запалення товстої кишки у мишей, його регуляторні механізми пов'язані з модуляцією кишкової мікробіоти та відновленням продукції глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP-1), що походить від кишечника.
Гранули BLG (без цукру, схвалені NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Пекін, Китай; номер партії: 20110966) були придбані в аптеках. DSS (молекулярна маса: 36 000–50 000 дальтон) був придбаний у MP Biologicals (Санта-Ана, США). Сульфасалазин (SASP) (чистота ≥ 98%), гематоксилін та еозин були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Набори для аналізу TNF-α, IL-1β та IL-6 luminex мишей були придбані у R&D systems (Міннеаполіс, Міннесота, США). Оцтова кислота, пропіонова кислота та масляна кислота були придбані у Aladdin Industries (Шанхай, Китай). 2-Етилмасляна кислота була придбана у Merck KGaA (Дармштадт, Німеччина).
6-8-тижневих самців мишей лінії C57BL/6 (маса тіла 18-22 г) було придбано у Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекін, Китай) та розміщено в середовищі з температурою 22 ± 2 °C з 12-годинним циклом світло/темрява. Мишей годували стандартним раціоном для гризунів з вільним доступом до питної води протягом одного тижня для акліматизації до нового середовища. Потім мишей випадковим чином розділили на чотири групи: контрольна група, модельна група DSS, група, що отримувала SASP (200 мг/кг, перорально), та група, що отримувала BLG (1 г/кг, перорально). Як показано на рисунку 1A, згідно з нашим попереднім дослідженням, експериментальний хронічний рецидивуючий коліт був індукований у мишей трьома циклами 1,8% DSS протягом 5 днів, а потім дистильованою водою протягом 7 днів, згідно з нашим попереднім дослідженням.18 Мишей у групах, що отримували SASP та BLG, лікували SASP та BLG відповідно щодня, починаючи з 0-го дня. Згідно з попередніми експериментами, доза BLG становила встановлено на рівні 1 г/кг. Тим часом, доза SASP була встановлена ​​на рівні 200 мг/кг згідно з літературою.4 Контрольна група та модель DSS отримували однаковий об'єм води протягом усього експерименту.
Рисунок 1. BLG покращує перебіг хронічного рецидивуючого коліту, індукованого DSS, у мишей. (A) Експериментальний дизайн хронічного рецидивуючого коліту та лікування, (B) зміна маси тіла, (C) показник індексу активності захворювання (DAI), (D) довжина товстої кишки, (E) репрезентативне зображення товстої кишки, (F) фарбування H&E. Товста кишка (збільшення, ×100) та (G) гістологічний показник. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 6).##p < 0,01 або ###p < 0,001 проти контрольної (Con) групи; *p < 0,05 або **p < 0,01 або ***p < 0,001 проти групи DSS.
Щодня реєстрували масу тіла, консистенцію калу та ректальні кровотечі. Індекс активності захворювання (ІАЗ) визначали шляхом об'єднання балів за масою тіла, консистенцією калу та ректальною кровотечею, як описано раніше.19 Наприкінці експерименту всіх мишей піддали евтаназії, а кров, кал та товсту кишку зібрали для подальших експериментів.
Тканину товстої кишки фіксували формаліном та заливали парафіном. Були зроблені 5-мікронні зрізи, забарвлені гематоксилін-еозином (H&E), потім засліплені та оцінені, як описано раніше.19
Загальну РНК тканини товстої кишки екстрагували за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія), а потім екстрагували кДНК за допомогою зворотної транскриптази (TaKaRa, Кусацу, Шига, Японія). Кількісну ПЛР проводили за допомогою системи ПЛР у реальному часі з SYBR Green Master (Roche, Базель, Швейцарія). Транскрипти цільових генів нормалізували відносно β-актину, а дані аналізували за допомогою методу 2-ΔΔCT. Послідовності праймерів генів наведено в таблиці 1.
Первинне виділення та культивування клітин товстої кишки мишей проводили, як описано раніше.20 Коротко кажучи, товсту кишку мишей віком 6-8 тижнів спочатку видаляли після умертвлення шляхом дислокації шийних відділів хребта, потім поздовжньо розкривали, обробляли збалансованим сольовим розчином Хенкса (HBSS, без кальцію та магнію) та нарізали на дрібні шматочки товщиною 0,5-1 мм. Згодом тканини розщеплювали 0,4 мг/мл колагенази XI (Sigma, Пул, Велика Британія) у вільному середовищі DMEM та центрифугували при 300 xg протягом 5 хвилин за кімнатної температури. Ресуспендували осад у середовищі DMEM (доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою, 100 одиниць/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину) при 37 °C та пропускали через нейлонову сітку (розмір пор ~250 мкм). Аліквоти клітин товстої кишки поміщали в чашки зі скляним дном та інкубували з оцтовою кислотою, пропіоновою кислотою, масляною кислотою та екстрактами мишачих фекалій протягом 2 годин при 37°C, 5% CO2.
Тканину товстої кишки гомогенізували за допомогою PBS, а рівні цитокінів IL-6, TNF-α та IL-1β у тканині товстої кишки визначали за допомогою наборів для аналізу luminex ELISA (R&D systems, Міннеаполіс, Міннесота, США). Аналогічно, рівні GLP-1 у сироватці крові та культуральному середовищі первинних клітин товстої кишки мишей визначали за допомогою набору ELISA (Bioswamp, Ухань, Китай) згідно з інструкціями виробника.
Загальну ДНК з фекалій екстрагували за допомогою набору для екстракції ДНК (Tiangen, Китай). Якість та кількість ДНК вимірювали у співвідношеннях 260 нм/280 нм та 260 нм/230 нм відповідно. Згодом, використовуючи кожну екстраговану ДНК як матрицю, специфічні праймери 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) та 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) використовували для ампліфікації ділянок V3-V4 гена 16S рРНК у різних ділянках. Продукти ПЛР очищали за допомогою набору для екстракції гелю QIAquick (QIAGEN, Німеччина), кількісно визначали за допомогою ПЛР у реальному часі та секвенували за допомогою платформи секвенування IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., Каліфорнія, США). Для біоінформатичного аналізу обробку даних проводили за раніше описаними протоколами.21,22 Коротше кажучи, для фільтрації необроблених експрес-файлів використовували Cutadapt (V1.9.1). OTU кластеризували за допомогою UPARSE (версія 7.0.1001) з порогом подібності 97%, а для видалення химерних послідовностей використовували UCHIME. Аналіз складу спільноти та класифікацію проводили за допомогою класифікатора RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) на основі бази даних генів рибосомної РНК SILVA.
Рівні коротколанцюгових жирних кислот (оцтової кислоти, пропіонової кислоти та масляної кислоти) вимірювали, як описано раніше Тао та ін., з деякими модифікаціями.23 Коротко кажучи, 100 мг фекалій спочатку суспендували у 0,4 мл деіонізованої води, потім у 0,1 мл 50% сірчаної кислоти та 0,5 мл 2-етилмасляної кислоти (внутрішній стандарт), потім гомогенізували та нагрівали при 4°C. Центрифугували при 12 000 об/хв протягом 15 хвилин при температурі 50°C. Супернатант екстрагували 0,5 мл ефіру та вводили в газовий хроматограф (ГХ) для аналізу. Для газової хроматографії (ГХ) зразки аналізували за допомогою газового хроматографа GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.), оснащеного полум'яно-іонізаційним детектором (FID). Розділення здійснювали за допомогою колонки ZKAT-624, 30 м × 0,53 мм × 0,3 мкм (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Китай). Дані отримували за допомогою програмного забезпечення для ГХ (Shimadzu, Inc.). Співвідношення розділення становило 10:1, газом-носієм був азот, а швидкість потоку становила 6 мл/хв. Об'єм введення становив 1 мкл. Температура інжектора та детектора становила 300°C. Температуру печі підтримували на рівні 140°C протягом 13,5 хвилин, потім збільшували до 250°C зі швидкістю 120°C/хв; температура трималася протягом 5 хвилин.
Дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення (SEM). Значущість даних оцінювали за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим використанням багатодіапазонного тесту Дункана. Для всіх розрахунків використовували програмне забезпечення GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США), а значення p < 0,05 вважали статистично значущим.
Загальновідомо, що ВК – це хронічне рецидивуюче захворювання коліту з сильним болем у животі, діареєю та кровотечею. Тому було встановлено хронічний рецидивуючий коліт, індукований DSS, у мишей для оцінки ефективності BLG проти коліту (рис. 1A). Порівняно з контрольною групою, миші в модельній групі DSS мали значно знижену масу тіла та вищий DAI, і ці зміни були значно зворотні після 24 днів лікування BLG (рис. 1B та C). Скорочення товстої кишки є важливою ознакою ВК. Як показано на рисунках 1D та E, довжина товстої кишки мишей, які отримували DSS, була значно скорочена, але лікування BLG полегшило її стан. Згодом було проведено гістопатологічний аналіз для оцінки запалення товстої кишки. Зображення, забарвлені H&E, та патологічні показники показали, що введення DSS значно порушило архітектуру товстої кишки та призвело до руйнування крипт, тоді як лікування BLG значно зменшило руйнування крипт та патологічні показники (рис. 1F та G). Примітно, що захисний ефект BLG у дозі 1 г/кг був порівнянний із захисним ефектом SASP у дозі 200 мг/кг. У сукупності ці результати свідчать про те, що BLG ефективно зменшує тяжкість хронічного рецидивуючого коліту, індукованого DSS, у мишей.
TNF-α, IL-1β та IL-6 є важливими запальними маркерами запалення товстої кишки. Як показано на рисунку 2A, DSS індукував значне збільшення експресії генів TNF-α, IL-1β та IL-6 у товстій кишці порівняно з контрольною групою. Введення BLG може значно змінити ці зміни, опосередковані DSS. Далі ми використовували ELISA для визначення рівнів запальних цитокінів TNF-α, IL-1β та IL-6 у тканині товстої кишки. Результати також показали, що рівні TNF-α, IL-1β та IL-6 у товстій кишці були значно підвищені у мишей, які отримували DSS, тоді як лікування BLG полегшило це збільшення (рисунок 2B).
Рисунок 2. BLG пригнічує експресію генів та продукцію прозапальних цитокінів TNF-α, IL-1β та IL-6 у товстій кишці мишей, оброблених DSS. (A) Експресія генів TNF-α, IL-1β та IL-6 у товстій кишці; (B) рівні білків TNF-α, IL-1β та IL-6 у товстій кишці. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 або ##p < 0,01 або ###p < 0,001 проти контрольної (Con) групи; *p < 0,05 або **p < 0,01 проти групи DSS.
Кишковий дисбактеріоз є критично важливим у патогенезі ВК.24 Щоб дослідити, чи модулює BLG кишкову мікробіоту мишей, оброблених DSS, було проведено секвенування 16S рРНК для аналізу бактеріальної спільноти вмісту кишечника. Діаграма Венна показує, що три групи мають 385 спільних OTU. Водночас кожна група мала унікальні OTU (рис. 3A). Крім того, індекс Chao1 та індекс Шеннона, показані на рисунках 3B та C, показали, що різноманітність спільноти кишкової мікробіоти була зменшена у мишей, оброблених BLG, оскільки індекс Шеннона був значно зменшений у групі, обробленій BLG. Аналіз головних компонентів (PCA) та аналіз головних координат (PCoA) були використані для визначення структури кластеризації між трьома групами та показали, що структура спільноти мишей, оброблених DSS, була чітко розділена після лікування BLG (рис. 3D та E). Ці дані свідчать про те, що лікування BLG суттєво вплинуло на структуру спільноти мишей з колітом, індукованим DSS.
Рисунок 3. BLG змінює різноманітність кишкової мікробіоти у мишей з колітом, індукованим DSS. (A) Діаграма Венна OTU, (B) Індекс Chao1, (C) Індекс багатства Шеннона, (D) Графік оцінки OTU за допомогою аналізу головних компонентів (PCA), (E) Оцінка за допомогою аналізу головних координат (PCoA) OTU. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 6).**p < 0,01 порівняно з групою DSS.
Щоб оцінити специфічні зміни у фекальній мікробіоті, ми проаналізували склад кишкової мікробіоти на всіх таксономічних рівнях. Як показано на рисунку 4A, основними типами у всіх групах були Firmicutes та Bacteroidetes, а потім Verrucomicrobia. Відносна чисельність Firmicutes та співвідношення Firmicutes/Bacteroidetes були значно збільшені у фекальних мікробних спільнотах мишей, оброблених DSS, порівняно з контрольними мишами, і ці зміни були значно зворотними після лікування BLG. Зокрема, лікування BLG значно збільшило відносну чисельність Verrucobacterium у калі мишей з колітом, індукованим DSS. На рівні домогосподарств фекальні мікробні спільноти були зайняті Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae та Prevotellaceae (рис. 4B). Порівняно з групою DSS, виснаження BLG збільшило чисельність Akkermansiaceae, але зменшило чисельність Lachnospiraceae та Ruminococcaceae. Примітно, що на рівні роду, Фекальна мікробіота була зайнята Lachnospira_NK4A136_група, Akkermansia та Prevotellaceae_UCG-001 (рис. 4C). Це відкриття також продемонструвало, що обробка BLG ефективно усунула дисбаланс мікробіоти у відповідь на зараження DSS, що характеризується зменшенням кількості Eubacterium_xylanophilum_група, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas та Oscillibacter, а також збільшенням кількості Akkermansia та Prevotellaceae_UCG-001.
Рисунок 4. BLG змінює чисельність кишкової мікробіоти у мишей з колітом, індукованим DSS. (A) Чисельність кишкової мікробіоти на рівні типу; (B) Чисельність кишкової мікробіоти на рівні родини; (C) Чисельність кишкової мікробіоти на рівні роду. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 6).#p < 0,05 або ###p < 0,001 проти контрольної (Con) групи; *p < 0,05 або **p < 0,01 або ***p < 0,001 проти групи DSS.
Враховуючи, що коротколанцюгові жирні кислоти (КЖК) є основними метаболітами Akkermansia та Prevotellaceae_UCG-001, тоді як ацетат, пропіонат та бутират є найпоширенішими КЖК у просвіті кишечника,25-27 ми все ще перебуваємо в кінці нашого дослідження. Як показано на рисунку 5, концентрації ацетату, пропіонату та бутирату у фекаліях були значно знижені в групі, що отримувала DSS, тоді як лікування BLG могло значно придушити це зниження.
Рисунок 5. BLG підвищує рівень SCFA у калі мишей з колітом, індукованим DSS. (A) Вміст оцтової кислоти у калі; (B) Вміст пропіонової кислоти у калі; (C) Вміст масляної кислоти у калі. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 6). #p < 0,05 або ##p < 0,01 проти контрольної (Con) групи; *p < 0,05 або **p < 0,01 проти групи DSS.
Далі ми розрахували коефіцієнт кореляції Пірсона між диференціальними SCFA на рівні роду та фекальною мікробіотою. Як показано на рисунку 6, Akkermansia позитивно корелювала з продукцією пропіонової кислоти (Pearson = 0,4866) та масляної кислоти (Pearson = 0,6192). На противагу цьому, як Enteromonas, так і Oscillobacter негативно корелювали з продукцією ацетату, з коефіцієнтами Пірсона 0,4709 та 0,5104 відповідно. Аналогічно, Ruminococcaceae_UCG-014 негативно корелював з продукцією пропіонової кислоти (Pearson = 0,4508) та масляної кислоти (Pearson = 0,5842) відповідно.
Рисунок 6. Аналіз кореляції Пірсона між диференціальними КЛЖК та мікробами товстої кишки. (A) Ентеромонада з оцтовою кислотою; (B) Паличка струсу мозку з оцтовою кислотою; (C) Аккермансія проти пропіонової кислоти; (D) Румінококус_UCG-014 з пропіоновою кислотою; (E) Аккермансія з масляною кислотою; (F) Румінококус_UCG-014 з масляною кислотою.
Глюкагоноподібний пептид-1 (GLP-1) – це клітинно-специфічний посттрансляційний продукт проглюкагону (Gcg) з протизапальними властивостями.28 Як показано на рисунку 7, DSS індукував значне зниження експресії мРНК Gcg. Обробка товстої кишки та BLG могла значно зменшити зниження Gcg, індуковане DSS, порівняно з контрольною групою (рис. 7A). Водночас рівень GLP-1 у сироватці крові був значно знижений у групі, обробленій DSS, і обробка BLG могла значно запобігти цьому зниженню (рис. 7B). Оскільки коротколанцюгові жирні кислоти можуть стимулювати секрецію GLP-1 через активацію рецептора 43, пов'язаного з G-білком (GRP43), та рецептора 41, пов'язаного з G-білком (GRP41), ми також дослідили GPR41 та GRP43 у товстій кишці мишей з колітом і виявили, що експресія мРНК GRP43 та GPR41 у товстій кишці значно знизилася після зараження DSS, і обробка BLG могла ефективно відновити це зниження (рис. 7C та D).
Рисунок 7. BLG підвищує рівень GLP-1 у сироватці крові та експресію мРНК Gcg, GPR41 та GRP43 у товстій кишці у мишей, оброблених DSS. (A) Експресія мРНК Gcg у тканині товстої кишки; (B) Рівень GLP-1 у сироватці крові; (C) Експресія мРНК GPR41 у тканині товстої кишки; (D) Експресія мРНК GPR43 у тканині товстої кишки. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 5–6).#p < 0,05 або ##p < 0,01 проти контрольної (Con) групи; *p < 0,05 проти групи DSS.
Оскільки лікування BLG могло підвищити рівень GLP-1 у сироватці крові, експресію мРНК Gcg у товстій кишці та рівень SCFA у фекаліях у мишей, оброблених DSS, ми додатково дослідили ацетат, пропіонат та бутират, а також у контрольних (F-Con), мишей з колітом DSS (F-Con) та мишей з колітом, оброблених BLG (F-BLG), щодо вивільнення GLP-1 з первинних епітеліальних клітин товстої кишки мишей. Як показано на рисунку 8A, первинні епітеліальні клітини товстої кишки мишей, оброблені 2 мМ оцтової кислоти, пропіонової кислоти та масляної кислоти відповідно, значно стимулювали вивільнення GLP-1, що узгоджується з попередніми дослідженнями.29,30 Аналогічно, всі F-Con, F-DSS та F-BLG (еквівалентно 0,25 г фекалій) значно стимулювали вивільнення GLP-1 з первинних епітеліальних клітин товстої кишки мишей. Примітно, що кількість GLP-1, вивільненого первинними епітеліальними клітинами товстої кишки мишей, обробленими F-DSS, була значно нижчою, ніж у первинних мишей, оброблених F-Con та F-BLG. епітеліальні клітини товстої кишки (Рисунок 8B). Ці дані свідчать про те, що лікування BLG значно відновило вироблення GLP-1, похідного від SCFA в кишечнику.
Рисунок 8. КЛЖК, отримані з BLG, стимулюють вивільнення GLP-1 з первинних клітин товстої кишки мишей. (A) Оцтова кислота, пропіонова кислота та масляна кислота стимулювали вивільнення GLP-1 з первинних клітин товстої кишки мишей; (B) фекальні екстракти F-Con, F-DSS та F-BLG стимулювали первинні клітини товстої кишки мишей. Кількість вивільненого GLP-1. Аліквоти клітин товстої кишки поміщали в чашки Петрі зі скляним дном та обробляли 2 мМ оцтовою кислотою, пропіоновою кислотою, масляною кислотою та фекальними екстрактами F-Con, F-DSS та F-BLG (еквівалентно 0,25 г фекалій) відповідно. 2 години при 37°C, 5% CO2 відповідно. Кількість GLP-1, вивільненого з первинних клітин товстої кишки мишей, визначали за допомогою ELISA. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 3). #p < 0,05 або ##p < 0,01 порівняно з порожнім аналізом або F-Con; *p < 0,05 порівняно з F-DSS.
Скорочення: Ace – оцтова кислота; Pro – пропіонова кислота; однак – масляна кислота; F-Con – екстракт фекалій контрольних мишей; F-DSS – екстракт фекалій мишей з колітом; F-BLG – з товстої кишки, обробленої BLG. Екстракти фекалій мишей із запальними захворюваннями.
Занесений Всесвітньою організацією охорони здоров'я до списку резистентних захворювань, НВК стає глобальною загрозою; Однак ефективні методи прогнозування, профілактики та лікування цього захворювання все ще обмежені. Тому існує нагальна потреба у дослідженні та розробці нових безпечних та ефективних терапевтичних стратегій для лікування ВК. Препарати традиційної китайської медицини є перспективним варіантом, оскільки багато препаратів традиційної китайської медицини протягом століть довели свою ефективність у лікуванні ВК у китайського населення, і всі вони є біологічними органічними та природними матеріалами, які здебільшого нешкідливі для людей і тварин.31,32 Це дослідження мало на меті пошук безпечного та ефективного препарату традиційної китайської медицини для лікування ВК та вивчення механізму його дії. Блакитний лускатий глікозид (BLG) – це добре відома китайська трав'яна формула, що використовується для лікування грипу.8,33 Робота в нашій лабораторії та інших показала, що індиго, оброблений продукт традиційної китайської медицини з тієї ж сировини, що й BLG, демонструє значну ефективність у лікуванні ВК у людей і тварин.4,34 Однак, протиколітний вплив BLG та його вплив незрозумілі. У цьому дослідженні наші результати демонструють, що BLG ефективно послаблює запалення товстої кишки, викликане DSS, яке пов'язане з модуляцією кишкової мікробіоти. та відновлення продукції GLP-1, що походить з кишечника.
Загальновідомо, що ВК характеризується рецидивуючими періодами з типовими клінічними ознаками, такими як втрата ваги, діарея, ректальна кровотеча та значне пошкодження слизової оболонки товстої кишки.35 Таким чином, хронічний рецидивуючий коліт лікували шляхом введення трьох циклів 1,8% DSS протягом п'яти днів, а потім сім днів пиття води. Як показано на рисунку 1B, коливання втрати ваги та показників DAI свідчили про успішну індукцію хронічного рецидивуючого коліту. Миші в групі, яка отримувала BLG, показали покращення відновлення з 8-го дня, що суттєво відрізнялося від 24-го дня. Такі ж зміни спостерігалися також у показниках DAI, що свідчить про покращення клінічного стану коліту. Що стосується пошкодження товстої кишки та запального статусу, довжина товстої кишки, пошкодження тканин товстої кишки, а також експресія генів та продукція прозапальних цитокінів TNF-α, IL-1β та IL-6 у тканині товстої кишки також значно покращилися після лікування BLG. У сукупності ці результати чітко демонструють, що BLG є ефективним у лікуванні хронічного рецидивуючого коліту у мишей.
Як BLG здійснює свої фармакологічні ефекти? Численні попередні дослідження показали, що кишкова мікробіота відіграє ключову роль у патогенезі ВК, а терапія на основі мікробіому та спрямована на мікробіом стала дуже привабливою стратегією для лікування ВК. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що лікування BLG призвело до значних змін у складі кишкової мікробіоти, що свідчить про те, що захисний ефект BLG проти коліту, індукованого DSS, пов'язаний з модуляцією кишкової мікробіоти. Це спостереження узгоджується з уявленням про те, що перепрограмування гомеостазу кишкової мікробіоти є важливим підходом до розуміння ефективності препаратів ТКМ.36,37 Примітно, що Akkermansia - це грамнегативна та суворо анаеробна бактерія, яка мешкає в слизовому шарі кишечника, розкладає муцини, виробляє пропіонову кислоту, стимулює диференціацію келихоподібних клітин та підтримує функцію цілісності бар'єру слизової оболонки.26 Численні клінічні дані та дані на тваринах свідчать про те, що Akkermansia тісно пов'язана зі здоровою слизовою оболонкою,38 а пероральне застосування Akkermansia spp. може значно покращити запалення слизової оболонки.39 Наші поточні дані свідчать про те, що відносна кількість Akkermansia значно збільшується після лікування BLG. Крім того, Prevotellaceae_UCG-001 є бактерією, що продукує SCFA.27 Численні дослідження показали, що Prevotellaceae_UCG-001 був виявлений у низькій відносній кількості у фекаліях тварин з колітом.40,41 Наші поточні дані також показують, що лікування BLG може значно збільшити відносну кількість Prevotellaceae_UCG-001 у товстій кишці мишей, які отримували DSS. На противагу цьому, Oscillibacter є мезофільною, суворо анаеробною бактерією.42 повідомлялося, що відносна кількість Oscillibacter була значно збільшена у мишей з UC та мала значну позитивну кореляцію з рівнями IL-6 та IL-1β та патологічними показниками.43,44 Примітно, що лікування BLG значно знизило відносну кількість Oscillibacter у фекаліях мишей, які отримували DSS. Примітно, що ці бактерії, змінені BLG, були найбільш продукуючими SCFA. Численні попередні дослідження продемонстрували потенційний корисний вплив SCFA. на запалення товстої кишки та захист цілісності кишкового епітелію.45,46 Наші поточні дані також показали, що концентрації ацетату, пропіонату та бутирату SCFA у фекаліях, оброблених DSS, значно збільшилися у мишей, які отримували BLG. У сукупності ці результати чітко демонструють, що лікування BLG може ефективно посилювати індуковані DSS SCFA бактерії, що продукують у мишей з хронічним рецидивуючим колітом.
ГПП-1 – це інкретин, який виробляється переважно в клубовій кишці та товстій кишці та відіграє важливу роль у затримці спорожнення шлунка та зниженні рівня глюкози в крові після прийому їжі.47 Дані свідчать про те, що дипептидилпептидаза (ДПП)-4, агоніст рецептора ГПП-1, та нанопрепарат ГПП-1 можуть ефективно полегшувати запалення кишечника у мишей.48-51 Як повідомлялося в попередніх дослідженнях, високі концентрації КЛЖК були пов'язані з рівнями ГПП-1 у плазмі крові у людей та мишей.52 Наші поточні дані показують, що після лікування BLG рівні ГПП-1 у сироватці крові та експресія мРНК Gcg значно підвищилися. Аналогічно, секреція ГПП-1 значно збільшилася в культурах товстої кишки після стимуляції фекальними екстрактами мишей з колітом, які отримували BLG, порівняно зі стимуляцією фекальними екстрактами мишей з колітом, які отримували DSS. Як КЛЖК впливають на вивільнення ГПП-1? Гвен Толхерст та ін. повідомлялося, що SCFA можуть стимулювати секрецію GLP-1 через GRP43 та GPR41.29 Наші поточні дані також показують, що лікування BLG значно збільшує експресію мРНК GRP43 та GPR41 у товстій кишці мишей, оброблених DSS. Ці дані свідчать про те, що лікування BLG може відновити стимульоване SCFA виробництво GLP-1 шляхом активації GRP43 та GPR41.
БЛГ – це препарат довгострокового застосування, що відпускається без рецепта (OTC), у Китаї. Максимально переносима доза БЛГ у мишей Куньміну становить 80 г/кг, і гострої токсичності не спостерігалося.53 Наразі рекомендована доза БЛГ (без цукру) для людей становить 9-15 г/день (3 рази на день). Наше дослідження показало, що БЛГ у дозі 1 г/кг покращує хронічний рецидивуючий коліт, викликаний DSS, у мишей. Ця доза близька до дози БЛГ, що використовується клінічно. Наше дослідження також виявило, що його механізм дії опосередковується, принаймні частково, змінами в кишковій мікробіоті, зокрема бактеріями, що продукують SCFA, такими як Akkermansia та Prevotellaceae_UCG-001, для відновлення вироблення GLP-1, що походить з кишечника. Ці результати свідчать про те, що БЛГ заслуговує на подальший розгляд як потенційний терапевтичний засіб для лікування клінічного коліту. Однак точний механізм, за допомогою якого він модулює кишкову мікробіоту, ще належить підтвердити за допомогою мишей з дефіцитом мікробіоти та трансплантації фекальних бактерій.
Ace, оцтова кислота; but, масляна кислота; BLG, пандан; DSS, декстрансульфат натрію; DAI, індекс активності захворювання; DPP, дипептидилпептидаза; FID, полум'яно-іонізаційний детектор; F-Con, контроль; Фекальні екстракти мишей; F-DSS, фекальні екстракти мишей з колітом DSS; F-BLG, фекальні екстракти мишей з колітом, яких лікували BLG; GLP-1, глюкагоноподібний пептид-1; Gcg, глюкагон; газова хроматографія, газова хроматографія; GRP43, рецептор, пов'язаний з G-білком 43; GRP41, рецептор, пов'язаний з G-білком 41; H&E, гематоксилін-еозин; HBSS, збалансований сольовий розчин Хенкса; OTC, OTC; PCA, аналіз головних компонентів; PCoA, аналіз головних координат; Pro, пропіонова кислота; SASP, сульфасалазин; SCFA, коротколанцюгові жирні кислоти; китайська медицина, традиційна китайська медицина; UC, виразковий коліт.
Усі експериментальні протоколи були схвалені Комітетом з етики тварин Пекінського університету Шеньчжень-Гонконгського університету науки і технологій медичного центру (Шеньчжень, Китай) відповідно до Інституційних рекомендацій та Правил щодо тварин (етичний номер A2020157).
Усі автори зробили значний внесок у розробку концепції та дизайну, збір даних або аналіз та інтерпретацію даних; брали участь у написанні статті або критичному перегляді важливого інтелектуального змісту; погодилися подати рукопис до поточного журналу; остаточно затвердили версію для публікації; відповідали за всі аспекти роботи.
Цю роботу було підтримано Національним фондом природничих наук Китаю (81560676 та 81660479), першокласним проектом Шеньчженьського університету (86000000210), Фондом Комітету з інновацій у галузі науки і технологій Шеньчженя (JCYJ20210324093810026) та Фондом досліджень медичної науки і технологій провінції Гуандун (A2020157 та A2020272), фармацевтичним закладом Медичного університету Гуйчжоу провінції Гуйчжоу, що фінансується Key Laboratory (YWZJ2020-01) та лікарнею Пекінського університету Шеньчжень (JCYJ2018009).
1. Тан Б., Чжу Дж., Чжан Б. та ін. Терапевтичний потенціал триптоліду як протизапального засобу при експериментальному коліті, індукованому декстраном сульфатом натрію, у мишей. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Каплан Г.Г. Глобальне навантаження на запальні захворювання кишечника (ЗЗК): з 2015 по 2025 рік. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Пен Дж., Чжен Т.Т., Лі Сюе та ін. Алкалоїди рослинного походження: перспективні модифікатори захворювання при запальних захворюваннях кишечника. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Сяо Хайтенг, Пен Цзе, Вень Б та ін. Indigo Naturalis пригнічує окислювальний стрес товстої кишки та реакції Th1/Th17 при коліті, індукованому DSS, у мишей. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Чен М., Дін Ю., Тонг З. Ефективність та безпека китайської фітотерапії з софорою жовтуватою (Sophora flavescens) у лікуванні виразкового коліту: клінічні дані та потенційні механізми. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Цао Фан, Лю Цзе, Ша Беньсін, Пан Х. Ф. Натуральні продукти: експериментально ефективні препарати для лікування запальних захворювань кишечника. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Чжан К., Цзян М., Лу А. Роздуми про ад'ювантне лікування виразкового коліту за допомогою традиційної китайської медицини. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Лі Чжунтен, Лі Лі, Чен Т.Т. та ін. Ефективність та безпека гранул Banlangen у лікуванні сезонного грипу: протокол дослідження для рандомізованого контрольованого дослідження. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x