Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
На відміну від хребетних, вважається, що комахи не мають статевих стероїдних гормонів, що контролюються самцями. У Anopheles gambiae стероїд екдизону 20-гідроксиекдизон (20E), ймовірно, еволюціонував для контролю розвитку яєць при синтезі самками2 та для індукції рефрактерного періоду спарювання при статевому перенесенні самцями3. Оскільки розвиток яєць та спарювання є важливими репродуктивними ознаками, розуміння того, як самки комарів Anopheles інтегрують ці гормональні сигнали, може сприяти розробці нових програм боротьби з малярією. Тут ми показуємо, що ці репродуктивні функції регулюються різними статевими стероїдами через складну мережу ферментів, що активують/інактивують екдистероїди. Ми ідентифікували специфічний для самців окислений екдизон, 3-дегідро-20E (3D20E), який захищає батьківство, припиняючи статеву сприйнятливість самок після статевого перенесення та активації шляхом дефосфорилювання. Примітно, що перенесення 3D20E також індукувало експресію репродуктивних генів, які підтримують розвиток яєць під час інфекції Plasmodium, забезпечуючи здоров'я інфікованих самок. 20E, отриманий у самок, не викликає статевої реакції. але дозволяє особинам, що спарюються, відкладати яйця після пригнічення 20E-інгібуючих кіназ. Ідентифікація цього специфічного для самців комах стероїдного гормону та його роль у регулюванні жіночої статевої сприйнятливості, фертильності та взаємодії з Plasmodium свідчить про потенціал зниження репродуктивного успіху комарів, що передають малярію.
Кількість випадків та смертей від малярії знову зростає4 через широку стійкість до інсектицидів у комарів Anopheles, єдиного переносника малярійних паразитів людини. Біологія спарювання цих комарів є особливо привабливою мішенню для нових заходів боротьби з малярією, оскільки самки паруються лише один раз5; стерилізація цього єдиного випадку спарювання мала б великий потенціал для зменшення популяцій комарів у польових умовах.
Жінки стають статево недієздатними після отримання від чоловіків стероїдних гормонів у високому титрі. Дослідження показали, що пусковим механізмом для труднощів у подальшому спарюванні є 20-гідроксиекдизон (20Е), стероїдний гормон, більш відомий як регулятор циклу линьки на личинковій стадії. Здатність самців синтезувати та переносити 20Е еволюціонувала саме у видів Anopheles, що належать до підроду Cellia7, який поширений в Африці та включає найнебезпечніших переносників малярії, включаючи Anopheles gambiae. Це особливо примітно, оскільки у цих видів самки також виробляють 20Е після кожного кровопостачання, і 20Е керує циклом оогенезу (див. посилання 8). Однак мало що відомо про те, як самки інтегрують сигнали з двох різних джерел екдизону (перенесення самцями та індукція кровопостачання), не ставлячи під загрозу власну здатність до спарювання. Фактично, якщо 20Е, що виробляється самками, викликає сексуальну непереносимість, це призведе до безпліддя у особин, що живляться незайманими, що є дуже поширеною поведінкою у цих комарів5.
Можливим поясненням є те, що самці A. gambiae передають модифікований чоловічий специфічний екдизон, який активує сигнальний каскад у жіночому репродуктивному тракті, що призводить до нестабільності спарювання. Однак, хоча хребетні мають кілька стероїдних гормонів, таких як естроген та андроген (огляд у посиланні 9), наскільки нам відомо, андрогенно-зміщені стероїди у комах не були виявлені.
Ми поставили собі за мету визначити репертуар стероїдних гормонів у чоловічій допоміжній залозі (MAG) статевозрілого A. gambiae у пошуках можливих модифікуючих стероїдів. Використовуючи високоефективну рідинну хроматографію в поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС/МС), а не менш специфічний метод, що використовувався раніше, ми виявили екдизон (Е) та 20Е у цій тканині, що підтверджує попередній результат. Однак, у зразку переважали окислені фосфорильовані стероїди, що відповідають формулі 3-дегідро-20Е-22-фосфат (3D20E22P)12 (Рисунок 1). Інші форми включають 3-дегідро-20Е (3D20E) та 20Е-22-фосфат (20E22P). Інтенсивність сигналу ВЕРХ-МС/МС 3D20E22P була на два порядки вищою, ніж у його дефосфорильованої форми, 3D20E, та на три порядки вищою, ніж у Е та 20Е (Рисунок 1). Хоча в інших частинах тіла та нижніх репродуктивних шляхах (LRT; Розширені дані, рис. 1a). Ми також проаналізували екдистероїди у щойно закритих (<1 дня) самців та самок і виявили 3D20E та 3D20E22P лише в MAG; E, 20E та 20E22P були присутні в обох статей (Розширені дані, рис. 1b). Ці дані свідчать про те, що дорослі самці A. gambiae виробляють високі титри модифікуючих гормонів у своїх MAG, які не синтезуються самками.
МАГ та жіночі ДРТ (включаючи передсердя, сім'яні міхурці та пароварій) були препаровані з 4-денних (4-денних) незайманих самців та незайманих і спарених самок (0,5, 3 та 12 годин на хвилину). Екдизон у цих тканинах аналізували за допомогою ВЕРХ-МС/МС (середнє ± стандартна помилка в аналізі; непарний t-тест, двосторонній, скоригований на коефіцієнт хибних результатів (FDR); NS, незначно; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 години проти 0,5 годин, P = 0,035; 12 годин проти 3 годин, P = 0,0015; 12 годин проти 0,5 годин, P = 0,030. 3D20E22P: 3 години проти 0,5 годин, P = 0,25; 12 годин проти 3 годин, P = 0,0032; 12 годин проти 0,5 годин, P = 0,015). Дані отримані з трьох біологічних повторностей. Площа піку для кожного екдизону, що нас цікавить, була розрахована та нормалізована за кількістю комарів. Екдизон представлений такими кольорами: E, зелений; 20E, помаранчевий; 20E22P, фіолетовий; 3D20E, синій; 3D20E22P, рожевий. Вставка збільшує масштаб на осі y, щоб показати нижчі рівні екдизону.
Щоб дослідити, чи переносяться 3D20E22P та 3D20E під час спарювання, ми препарували жіночі LRT у різні моменти часу після спарювання. Хоча екдизон не був виявлений у незайманих самках, ми спостерігали значну кількість 3D20E22P у LRT одразу після спарювання (0,5 години після спарювання, год/хв), яка з часом зменшувалася, тоді як рівні 3D20E значно зростали (рис. 1). Використовуючи хімічно синтезований 3D20E як стандарт, ми визначили, що рівні цього стероїдного гормону в LRT під час спарювання були щонайменше у 100 разів вищими, ніж 20E (Таблиця розширених даних 1). Таким чином, 3D20E22P є основним чоловічим екдизоном, який переноситься до жіночого LRT під час спарювання, а його дефосфорильована форма, 3D20E, стає дуже поширеною невдовзі після спарювання. Це свідчить про важливу роль останнього екдизону в біології самок після спарювання.
Після створення нового набору даних РНК-секвенування (RNA-seq) (рис. 2a), використовуючи спеціально розроблений біоінформаційний конвеєр, ми шукали екдизонкіназу (EcK), екдизоноксидазу (EO) та ген екдизон-кодуючої 20E-модифікованої фосфатази. EPP) експресується в репродуктивних тканинах. Ми ідентифікували один кандидатний ген EPP та два потенційні гени EcK (EcK1 та EcK2), але не змогли знайти хороший кандидатний ген EO. Примітно, що окремі гени EPP експресувалися на високих рівнях (98,9-й процентиль) у гамбійських MAG, але не у жіночих LRT (рис. 2b), всупереч нашим очікуванням, оскільки дефосфорилювання 3D20E22P відбувалося в цій жіночій тканині. Тому ми вважаємо, що чоловічий EPP може бути переданий під час спарювання. Дійсно, ми використовували мічення стабільними ізотопами in vivo, щоб замаскувати жіночий білок після спарювання, фермент, ідентифікований за допомогою MS у жіночому передсерді (рис. 2c та Додаткова таблиця 1). Присутність EPP у MAG та спарених (але не незайманих) самиць LRT також було підтверджено за допомогою специфічних антитіл (рис. 2d).
a, Спеціально розроблений біоінформаційний конвеєр для пошуку генів, що кодують EcK, EO та EPP, у репродуктивних тканинах кожної статі. Числа поруч зі стрілками вказують на кількість кандидатів чоловічої та жіночої статі на кожному кроці. Цей аналіз ідентифікував один ген EPP (EPP) та один ген EcK (EcK1), які експресуються у самців, та один ген EcK (EcK2), який експресується в обох статей, але не дає гена-кандидата EO.b, Теплова карта, що порівнює експресію генів-кандидатів у незайманих (V) та парувальних (M) тканинах Anopheles gambiae та Anopheles albicans. Spca, запліднення; MAG, допоміжні залози у самців; інші частини тіла, включаючи груди, крила, ноги, жирові тіла та внутрішні органи в обох статей, а також яєчники у самок. EcK2 високо експресується як у MAG, так і в передсердях Гамбії, тоді як EPP виявляється лише в MAG.c, Протеомний аналіз транслокації групи чоловічого еякуляту в жіночі передсердя через 3, 12 та 24 години на хвилину, показуючи 67 найпоширеніших білків. Самок вирощували на дієті, що містила 15N для мічення (та маскування) всіх білків. Немічених самців спаровували з міченими самками, а жіночі LRT препарували через 3, 12 та 24 години на хвилину для протеомного аналізу (див. Додаткову таблицю 1 для повного списку еякуляторних білків). На вставці EPP, Eck1 та EcK2 були виявлені в MAG незайманих самців шляхом протеомного аналізу цих тканин.d, EPP був виявлений за допомогою вестерн-блоттингу в MAG та LRT спарених самок, але не у незайманих самок чи самців або решти тіла самки. Мембрани були одночасно зондували анти-актиновими (контроль завантаження) та анти-EPP антитілами. Усі самці є незайманими. Див. Додатковий рисунок 1 для отримання даних про вихідний гель. Вестерн-блот проводили двічі з подібними результатами.
Активність екдистероїдної фосфофосфатази EPP була підтверджена після інкубації за допомогою ВЕРХ-МС/МС з 3D20E22P, виділеним з MAG (розширені дані, рис. 2a). Крім того, коли ми приглушували EPP за допомогою РНК-опосередкованої інтерференції (RNAi), ми виявили сильне зниження активності фосфатази в репродуктивних тканинах цих самців (рис. 3a), а самки, що спарювалися з самцями з приглушеним EPP, показали значно нижчу частку дефосфорильованого 3D20E (рис. 3b), незважаючи на часткове приглушення генів (розширені дані, рис. 2b,c). На противагу цьому, ми не виявили значних змін у співвідношенні 20E22P/20E у тих самих комарів, що може свідчити про те, що фермент є специфічним для 3D20E22P (рис. 3b).
a, Зниження активності фосфатази в MAG, спричинене заглушенням EPP за допомогою контрольних зразків дволанцюгової EPP РНК (dsEPP) або дволанцюгової GFP РНК (dsGFP). У кожному повторі було використано двадцять пулів MAG (P = 0,0046, парний t-тест, двосторонній), представлених окремими крапками.b, Самки, схрещені з самцями з заглушеним EPP, мали значно нижчу частку дефосфорильованого 3D20E при 3 hpm (P = 0,0043, непарний t-тест, двосторонній), тоді як рівні 20E залишалися незмінними (P = 0,063, непарний). t-критерій, двосторонній). Дані представлені як середнє значення ± стандартна помилка (SEM) з трьох пулів по 13, 16 та 19 самиць кожен.c. Самки, що спарювалися з самцями з приглушеним EPP, мали значно вищі показники повторного спарювання (P = 0,0002, точний критерій Фішера, двосторонній). Самок спочатку змушували спарюватися, щоб переконатися в їхньому парному статусі; Через 2 дні їх зв'язали з іншими самцями, які носіїв трансгенної сперми, щоб оцінити частоту повторного спарювання за допомогою кількісної ПЛР-детекторної діагностики трансгену.d Самок, яких годували кров'ю та спарювали з самцями з приглушеним EPP, мали значно знижену фертильність (P < 0,0001; тест Манна-Вітні, двосторонній) та дещо зменшену кількість яєць (P = 0,088, тест Манна-Вітні, двосторонній), тоді як частота нересту не змінилася (P = 0,94, точний тест Фішера, двосторонній). У всіх панелях n позначає кількість біологічно незалежних зразків комарів.NS, не суттєво.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Далі ми оцінили, чи є дефосфорилювання екдизону важливим для індукції стійкості до спарювання у самок. Примітно, що самки, які спарювалися з самцями з виснаженим EPP, повторно спарювалися з набагато вищою частотою (44,9%), ніж контрольні самки (10,4%), коли їх контактували з додатковими (трансгенними) самцями (рис. 3c). Ми також спостерігали значне зниження фертильності (рис. 3d, ліворуч) та незначне зменшення кількості яєць, відкладених цими самками (рис. 3d, посередині), тоді як відсоток яєць, відкладених самками (ще одна реакція, викликана у самок спарюванням), не змінився (рис. 3d, праворуч). Враховуючи спостережувану специфічність EPP для 3D20E22P, ці результати свідчать про те, що активація 3D20E за допомогою EPP, що передається під час спарювання, може відігравати важливу роль у вимкненні сприйнятливості самок до подальшого спарювання, поведінки, яку раніше приписували статевій передачі 20E. Отже, цей чоловічий специфічний гормон також сильно впливає на фертильність самок.
Далі ми порівняли активність 20E та 3D20E в експериментах з ін'єкціями у статевозрілих незайманих самок, використовуючи хімічно синтезований 3D20E (рис. 4a–c) та комерційно доступний 20E. Ми спостерігали, що 3D20E був значно ефективнішим, ніж 20E, у пригніченні чутливості самок до спарювання при обох концентраціях (рис. 4d). Примітно, що половина фізіологічного рівня 3D20E в LRT (1066 пг після ін'єкції проти 2022 пг після спарювання) індукувала частку рефрактерних самок, яка була в 20 разів вищою, ніж фізіологічний рівень 20E (361 пг після ін'єкції) через 24 години після ін'єкції при найвищій концентрації 18 пг після спарювання; Розширені дані (таблиця 1). Цей результат узгоджується з уявленням про те, що статеве перенесення 20E не викликає рефрактерних періодів спарювання, і додатково вказує на 3D20E як основний фактор у забезпеченні стосунків між батьками та дитиною. 3D20E також був значно активнішим, ніж 20E, в аналізах відкладання яєць у незайманих самок (рис. 4e), що свідчить про те, що нормальна швидкість відкладання яєць, яку ми спостерігали після часткового заглушення EPP, була зумовлена ​​наявністю залишкової активності 3D20E, яка все ще виробляється факторами, індукованими спарюванням у самок.
(a,b) 3D20E хімічно синтезовано з 20E (a) з дуже високою конверсією/ефективністю (дані представлені як середнє ± стандартна помилка відхилень з трьох незалежних реакцій синтезу) (b).c, Мас-спектр (нижня половина) точно відповідає екдизону, виявленому у спарених самицях LRT (верхня половина).d, Порівняно з 20E (0,63 мкг, P = 0,02; 0,21 мкг, P < 0,0001; точний тест Фішера, двосторонній) та 10% етанолом (0,63 мкг, P < 0,0001; 0,21 мкг, P < 0,0001; точний тест Фішера, двосторонній), тоді як 20E був значно вищим, ніж у контролі, лише при вищих дозах (0,63 мкг, P = 0,0002; 0,21 мкг, P = 0,54; точний тест Фішера, двосторонній).e, Ін'єкція 3D20E індукувала значно вищі показники нересту у незайманих самок, ніж у контрольних групах з 10% етанолом (0,21 мкг, P < 0,0001; 0,13 мкг, P = 0,0003; точний тест Фішера, двосторонній), тоді як 20E порівняно з контрольними групами лише при вищих дозах (0,21 мкг, P = 0,022; 0,13 мкг, P = 0,0823; точний тест Фішера, двосторонній). 3D20E індукував значно вищі показники нересту, ніж 20E при вищих дозах (0,21 мкг, P = 0,0019; 0,13 мкг, P = 0,075; точний тест Фішера, двосторонній). На всіх панелях n позначає кількість біологічно незалежних зразків комарів. NS, не суттєво. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Дані отримані з трьох реплікує.
У попередніх дослідженнях ми визначили, що статевий перенос стероїдних гормонів індукує експресію MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), жіночого репродуктивного гена, який захищає самок A. gambiae від інфекції P. falciparum. Медичні витрати, спричинені 13, найсмертоноснішим малярійним паразитом людини. Враховуючи важливість MISO для репродуктивної придатності Anopheles в ендемічних по малярії районах, ми вирішили визначити, який гормон 3D20E чи 20E запускає експресію цього гена. Ми виявили, що хоча ін'єкція 20E специфічно або потужніше індукувала деякі ядерні гормональні рецептори (HR), такі як HR3 та HR4, та типові стероїдні мішені нижче за течією, такі як йолкогенні гени Vg14, 15, 16, MISO сильніше індукувався 3D20E (Розширені дані, рис. 3). Таким чином, статевий перенос цього андрогенного стероїдного гормону, здається, індукує механізми, що захищають самок від витрат, спричинених паразитарною інфекцією. Крім того, 3D20E диференційно впливає на обидві ізоформи E-рецептор EcR, індукуючи EcR-A та пригнічуючи EcR-B, і сильніше запускаючи інші гени, що індукують спарювання, включаючи HPX15, який впливає на жіночу фертильність. Це може пояснити значну безплідність, що спостерігається у самок, що спарювалися з самцями з пригніченим EPP (розширені дані, рис. 3). Ці дані свідчать про існування низхідних шляхів, переважно активованих двома гормонами екдизону, які можуть лежати в основі статево-специфічної функції.
Далі ми протестували функцію двох генів EcK, ідентифікованих у нашому біоінформатичному конвеєрі. Пригнічення EcK1 або EcK2 призвело до значної смертності у чоловіків (Розширені дані, рис. 4a), що свідчить про те, що фосфорилювання екдизону, а отже, і інактивація, важливі для виживання. Оскільки EcK2 експресувався на вищих рівнях, ніж EcK1, і був виявлений у MAG за допомогою протеоміки (рис. 2b,c та Додаткова таблиця 2), ми підтвердили його екдистероїд-кіназну активність, інкубуючи його з 20E, що призвело до фосфорилювання 20E22P (Розширені дані, рис. 2).4b). При використанні 3D20E як субстрату ми не змогли виявити фосфорильований продукт 3D20E22P (Розширені дані, рис. 4c), що свідчить про те, що 20E, а не 3D20E, може бути кращою мішенню EcK2.
Згідно з нашим аналізом РНК-секвенування, EcK2 також високо експресувався в LRT незайманих самок, де він вимикався після спарювання (рис. 2b). Ми підтвердили ці дані та визначили, що експресія EcK2 не зазнала впливу кровопостачання (розширені дані, рис. 5a). Розширюючи наші початкові експерименти з мас-спектрометрією, ми визначили, що пік 20E22P був тісно пов'язаний з піком 20E (через 22-26 годин після кровопостачання; розширені дані, рис. 5b). Пригнічення EcK2 у незайманих самок призвело до 3-кратного збільшення відносного співвідношення 20E до 20E22P через 26 годин після кровопостачання (розширені дані, рис. 2c та 5c), що підтверджує, що EcK2 також фосфорилює 20E у самок. Примітно, що незаймані самок з дефіцитом EcK2 зберігали повну сексуальну рецептивність (розширені дані, рис. 5d,e), що додатково свідчить про те, що вироблення 20E у самок не викликає рефрактерних періодів спарювання. Однак ці самки мали значно... підвищені показники відкладання яєць порівняно з контрольною групою, причому понад 30% незайманих особин відкладали яйця (Розширені дані, рис. 5f). Якщо ін'єкції дволанцюгової РНК Eck2 (dsEcK2) проводилися після годування кров'ю, нерест не відбувався, і в цей момент пік 20E, пов'язаний з проковтуванням крові, зменшувався. Загалом, ці результати підтверджують модель, згідно з якою 20E, що виробляється після смоктання крові, може викликати нерест, але лише тоді, коли блок нересту (EcK2 та, можливо, інші фактори) вимикається спарюванням. Ні ін'єкції 20E, ні 3D20E не пригнічували експресію EcK2 у незайманих особин (Розширені дані, рис. 5g), що свідчить про те, що інші фактори опосередковують пригнічення цієї кінази. Однак рівні 20E після годування кров'ю були недостатніми для викликання дискомфорту при спарюванні, але були ефективно викликані високими титрами 3D20E, що передаються статевим шляхом.
Наші результати дають важливе розуміння механізмів, що регулюють репродуктивний успіх A. gambiae. З'явилася модель, де самці еволюціонували до синтезу високих титрів 3D20E, специфічного для самців модифікованого екдизону, який забезпечує батьківство, десенсибілізуючи самок до подальшого спарювання. Водночас ці переносники малярії також розвинули ефективну систему для активації 3D20E у самок у відповідь на статеву передачу специфічного для самців EPP. Наскільки нам відомо, це перший приклад системи стероїдних гормонів, в якій домінують самці та самки, що виконує унікальну та критичну функцію у комах. Специфічна для самців функція екдизону була постульована, але остаточно не продемонстрована. Наприклад, значною мірою спростована гіпотеза 18 полягає в тому, що ці функції можуть виконуватися попередником 20E E1. Добре відомо, що у дрозофіли монандрія запускається статевою передачею малих статевих пептидів 19,20, які взаємодіють з нейронами, що іннервують жіночий репродуктивний тракт, через специфічні рецептори статевих пептидів 21,22. Необхідна подальша робота для визначення каскадів сигнальних шляхів нижче за течією. контрольовані 3D20E у самок A. gambiae та визначити, чи можуть ці каскади бути збереженими між комарами та дрозофілою.
Враховуючи важливу роль 3D20E у жіночій фертильності та поведінці, виявлену в нашому дослідженні, шляхи, що ведуть до синтезу та активації 3D20E, пропонують нові можливості для майбутніх стратегій боротьби з комарами, таких як генерація конкурентоспроможних стерильних самців у стратегіях технології стерильних комах, що використовуються для випуску в дику природу або для імітації 3D20E у грі незайманих. Специфічна для самців функція 3D20E, можливо, еволюціонувала, коли A. gambiae та інші види Cellia набули здатності коагуляти свою сперму в партнерські пробки, оскільки це дозволяє ефективно передавати велику кількість гормонів та ферментів, що активують гормони. У свою чергу, еволюція 3D20E, що впроваджує монандрію, забезпечує механізм для самок (завдяки високій експресії MISO) для сприяння їхній репродуктивній придатності в районах з високою поширеністю малярії, що опосередковано сприяє передачі плазмодія. Враховуючи, що було показано, що жіночий 20E має глибокий вплив на виживання та ріст P. falciparum у самок комарів Anopheles,24 шляхи стероїдних гормонів як чоловічих, так і жіночих зараз є ключовими аспектами взаємодії комарів і паразитів.
Штами A. gambiae G3 вирощували за стандартних умов для комах (26-28 °C, відносна вологість 65-80%, фотоперіод світло/темрява 12:12 год). Личинок годували порошкоподібним кормом для риб (пластівці TetraMin Tropical Flakes, гранули Koi та палички Tetra Pond Sticks у співвідношенні 7:7:2). Дорослих комарів годували досхочу 10% розчином декстрози та щотижнево кров’ю людини (компоненти крові для дослідження). Незайманих комарів отримували шляхом розділення статей на стадії лялечки після дослідження кінцівок за допомогою мікроскопії. Самці, що несуть трансген DsRed, були описані раніше.
Експерименти з примусового спарювання проводили згідно з раніше описаними протоколами. Для природного спарювання 4-денних незайманих самок утримували у співвідношенні 1:3 зі статевозрілими незайманими самцями протягом двох ночей. В експериментах, в яких самцям вводили dsEPP, спільне утримання в клітках збігалося з 3-4 днями після ін'єкції, коли активність фосфатази була максимально пригнічена (Розширені дані, рис. 2b).
Тканини комарів, залишки трупів (решта тіла) або все тіло препарували у 100% метанолі та гомогенізували за допомогою бідера (скляні кульки 2 мм, 2400 об/хв, 90 сек). Кількість тканин та об'єм метанолу були наступними: решта тіла, 50 на 1000 мкл; MAG, 50–100 по 80 мкл; жіночі LRT, 25–50 по 80 мкл. Осад піддавали другій метанольній екстракції з тим самим об'ємом метанолу. Клітинні залишки видаляли центрифугуванням. Метанол з обох екстракцій об'єднували та сушили під потоком азоту, потім ресуспендували в таких об'ємах 80% метанолу у воді: решта тіла, 50 мкл; MAG та жіночі LRT, 30 мкл.
Зразки аналізували на мас-спектрометрі (ID-X, Thermo Fisher), підключеному до приладу для рідкокристалічного хроматографа (Vanquish, Thermo Fisher). 5 мкл зразка вводили на колонку з розміром 3 мкм, розміром 100 × 4,6 мм (Inspire C8, Dikma), що підтримувалася при температурі 25 °C. Рухомими фазами для рідкокристалічного хроматографа були A (вода, 0,1% мурашина кислота) та B (ацетонітрил, 0,1% мурашина кислота). Градієнт рідкокристалічного хроматографа був наступним: 5% B протягом 1 хвилини, потім збільшували до 100% B протягом 11 хвилин. Після 8 хвилин при 100% колонку знову врівноважували при 5% B протягом 4 хвилин. Швидкість потоку становила 0,3 мл/хв. Іонізація в джерелі мас-спектрометрії здійснюється шляхом нагрівання електророзпилювальної іонізації в позитивному та негативному режимах.
Мас-спектрометр вимірює дані в діапазоні m/z від 350 до 680 з роздільною здатністю 60 000 у режимі повної мас-спектрометрії (MS). Дані MS/MS були отримані для [M + H]+ (всі мішені), [M - H2O + H]+ (всі мішені) та [M - H]- (фосфорильовані мішені). Дані MS/MS були використані для підтвердження властивостей екдизону мішеней, для яких не було стандарту. Для ідентифікації нецільових екдистероїдів були проаналізовані дані MS/MS для всіх піків ВЕРХ з відносною кількістю >15%. Кількісно визначте за допомогою стандартних кривих, створених з чистих стандартів (20E, 3D20E), щоб розрахувати абсолютні кількості або розведення одного конкретного зразка (всі інші мішені) для розрахунку їх еквівалентності кількостям, виявленим у одного самця. Для 3D20E кількісне визначення було проведено з використанням суми наступних аддуктів: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Дані були вилучені та кількісно визначені за допомогою Tracefinder (версія 4.1).Дані MS/MS були проаналізовані за допомогою Xcalibur (версія 4.4).MS-спектри E, 20E та 3D20E порівнювали з відповідними стандартами. 3D20E22P аналізували шляхом дериватизації з реактивом Жирара. 20E22P аналізували за співвідношенням m/z.
3D20E22P було очищено з MAG. Очищення проводили в аналітичному масштабі за допомогою надпродуктивного рідинного хроматографа (Acquity, Waters) з квадрупольним мас-детектором (QDa, Acquity, Waters) за тих самих умов LC, що й для аналізу ВЕРХ-МС/МС. Збір фракцій запускали, коли m/z, що відповідає 3D20E22P, було виявлено за того ж часу утримування, що й раніше. Чистоту екстрагованих сполук потім перевіряли за допомогою ВЕРХ-МС/МС, як описано вище.
Загальну РНК екстрагували з 10-12 репродуктивних тканин або інших частин тіла (без голів) за допомогою реагенту TRI (Thermo Fisher) згідно з інструкціями виробника. РНК обробляли TURBO ДНКазою (Thermo Fisher). кДНК синтезували за допомогою зворотної транскриптази вірусу лейкемії мишей Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) згідно з інструкціями виробника. Праймери для кількісної ПЛР зі зворотною транскрипцією (RT-qPCR; Розширена таблиця даних 2) були опубліковані раніше24 або розроблені з використанням Primer-BLAST26, причому перевага надавалася продуктам розміром 70-150 п.н., що охоплюють екзон-екзонні з'єднання, або пара праймерів окремих екзонів. Зразки кДНК з трьох-чотирьох біологічних повторів розводили в чотири рази водою для RT-qPCR. Кількісне визначення проводили в 15 мкл повторних реакціях, що містили 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймери та 5 мкл розведеної кДНК. Реакції проводили на системі ПЛР у реальному часі QuantStudio 6 Pro (Thermo Фішер), а дані були зібрані та проаналізовані за допомогою Design and Analysis (версія 2.4.3). Як показано в цьому дослідженні, відносні кількості були нормалізовані відносно рибосомного гена RpL19 (AGAP004422), експресія якого суттєво не змінювалася при кровообігу 27 або спарюванні 3.
Якість РНК перевіряли за допомогою Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Бібліотеки парних кінців Illumina були підготовлені та запущені в Інституті Броуда Массачусетського технологічного інституту та Гарварду. Секвенування було вирівняно з геномом A. gambiae (штам PEST, версія 4.12) за допомогою HISAT2 (версія 2.0.5) з параметрами за замовчуванням. Зчитування з оцінками якості картування (MAPQ) <30 було видалено за допомогою Samtools (версія 1.3.1). Кількість зчитувань, зіставлених з генами, підраховували за допомогою htseq-count (версія 0.9.1) з параметрами за замовчуванням. Нормалізовані підрахунки зчитувань були розраховані, а диференціальна експресія генів проаналізована за допомогою пакета DESeq2 (версія 1.28.1) в R (версія 4.0.3).
Гени-кандидати, що модифікують екдизон, були ідентифіковані шляхом попереднього пошуку в геномі A. gambiae за допомогою алгоритму PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) з використанням значень параметрів за замовчуванням з наступними послідовностями білків запиту: з Bombyx mori (номер доступу NP_001038956.1), Musca domestica (номер доступу XP_005182020.1, XP_005175332.1 та XP_011294434.1) та Microplitis demolitor (номер доступу XP_008552646.1 та XP_008552645.1) EcK з B. mori (номер доступу NP_001036900), Drosophila melanogaster (номер доступу NP_651202), Apis mellifera (номер доступу XP_394838) та Acyrthosiphon pisum (номер доступу XP_001947166); та EPP від ​​B. mori (номер доступу XP_001947166) NP_001177919.1 та NP_001243996.1) та EO D. melanogaster (номер доступу NP_572986.1) (крок 1). Далі, фільтруйте хіти на основі високої експресії мРНК (>100 фрагментів/кілобаз екзонів на мільйон картованих зчитувань (FPKM) або >85%) у репродуктивній тканині (жіноча LRT або MAG) у Гамбії (крок 2). Для покращення специфічності ми відібрали кандидатні ферменти, які також експресуються в репродуктивній тканині A. albimanus, виду Anopheles, який не синтезує та не переносить екдизон під час спарювання. Гени-кандидати були відфільтровані на основі низької експресії (<100 FPKM або <85-й процентиль) у репродуктивній тканині A. albimanus (крок 3). Як остаточний фільтр (крок 4), гени-кандидати повинні відповідати принаймні одному з наступних критеріїв: (1) значно підвищена регуляція після спарювання (P < 0,05) згідно з аналізом диференційно експресованих генів та (2) у нерепродуктивних тканинах (< 85 % або <100 FPKM).
Ми модифікували раніше описані методи 28, 29, 30 для досягнення ізотопного мічення цілого організму. Коротко кажучи, дикий тип Saccharomyces cerevisiae типу II (YSC2, Sigma) був протестований у дріжджовому азотистому середовищі (BD Difco, DF0335), що містить (мас./об.) 2% глюкози (G7528, Sigma), 1,7% середовища для культивування без амінокислот та сульфату амонію та 5% 15N сульфату амонію (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) як єдине джерело азоту. Дріжджі були виділені центрифугуванням, а личинок комарів годували досхочу до заляльковування. Доповнювали рибним борошном (0,5 мг на 300 личинок) для запобігання смертності четвертого віку. Потім у експериментах зі спарювання з неміченими самцями використовували лише самок для аналізу протеому самців, перенесеного під час спарювання.
4-6-денних 15N-мічених незайманих самок змушували спаровуватися з неміченими незайманими самцями відповідного віку. Успішне спаровування перевіряли шляхом виявлення парувальних пробок під епіфлуоресцентною мікроскопією. Через 3, 12 та 24 години на хвилину передсердя 45-55 спарених самок препарували в 50 мкл буфера бікарбонату амонію (pH 7,8) та гомогенізували товкачиком. Гомогенат центрифугували, а супернатант змішували з 50 мкл 0,1% RapiGest (186001860, Waters) у 50 мМ бікарбонату амонію. Супернатант та осад з кожного зразка швидко заморожували на сухому льоду та відправляли на ніч до лабораторії MacCoss в Університеті Вашингтона, де завершували підготовку зразків для LC-MS/MS. Ресуспендували осад у 50 мкл 0,1% RapiGest у 50 мМ бікарбонату амонію та обробляли ультразвуком на водяній бані. Концентрацію білка в осаді та супернатанті вимірювали за допомогою BCA. У цьому аналізі зразки відновлювали 5 мМ дитіотреїтолом (DTT; Sigma), алкілували 15 мМ йодацетамідом (Sigma) та інкубували при 37 °C (1:0–50) протягом 1 години у співвідношенні трипсинізація:трипсин:субстрат). RapiGest лізували додаванням 200 мМ HCl, потім інкубували при 37 °C протягом 45 хвилин та центрифугували при 14 000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 °C для видалення залишків речовини. Зразки промивали дворежимною твердофазною екстракцією (картриджі Oasis MCX, Waters) та ресуспендували в 0,1% мурашиній кислоті для кінцевої концентрації білка 0,33 мкг/мкл. Немічені MAG-протеоми аналогічно аналізували у самців-незайнятих особин. Для кожного зразка аналізували два аналітичні повтори. Далі 1 мкг кожного аналізували за допомогою 25-см колонки з плавленим кварцовим шаром 75 мкм та 4-см... Фриттова пастка з плавленого кварцу Kasil1 (PQ), заповнена обернено-фазовою смолою Jupiter C12 (Phenomenex), та 180-хвилинна рідинна хроматографія. Розщеплення зразків – MS/MS проводили на мас-спектрометрі Q-Exactive HF (Thermo Fisher) з системою nanoACQUITY UPLC (Waters). Дані, пов'язані з отриманням даних, отримані для кожного запуску, були перетворені у формат mzML за допомогою Proteowizard (версія 3.0.20287) та за допомогою Comet31 (версія 3.2) у базі даних FASTA, що містить білкові послідовності Anopheles gambiae (VectorBase версія 54), Anopheles coluzzi. Пошук було проведено за Mali-NIH (VectorBase версія 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, березень 2021 р.), RNA-seq A. gambiae та трикадровим трансляціям відомих забруднювачів людини. FDR, зіставлені з пептидною картою, були визначені за допомогою Percolator32 (версія 3.05) з порогом 0,01, а пептиди були зібрані в білкові ідентифікації за допомогою методу скорочення білків у Limelight33 (версія 2.2.0). Відносну кількість білка оцінювали за допомогою нормалізованого коефіцієнта спектральної кількості (NSAF), розрахованого для кожного білка в кожному прогоні, як описано раніше. NSAF відносно кожного білка усереднювали для зразків з двох різних біологічних повторностей. Мічення 15N успішно маскувало жіночий протеом, хоча невелику кількість неміченого білка можна було виявити з мічених незайманих зразків. Ми зафіксували виявлення зниження вмісту чоловічого білка (1-5 спектри) у необроблених жіночих зразках лише в технічних прогонах, де необроблені зразки аналізували після зразків чоловічої/спарювальної групи, в результаті «перенесення» ВЕРХ. Інколи виявлені білки як «забруднювачі» з мічених незайманих зразків перелічені в Додатковій таблиці 1.
Два антигенні пептиди, QTTDRVAPAPDQQQ (в межах ізотипу PA) та MESDGTTPSGDSEQ (в межах ізотипу PA та PB) у Genscript. Два пептиди об'єднали, потім кон'югували з білком-носієм KLH та ввели новозеландським кроликам. Кроликів умертвили після четвертої ін'єкції, а загальний IgG виділили за допомогою афінної очистки. IgG від найбільш EPP-специфічного кролика використовували для подальшого вестерн-блоттингу.
Для вестерн-блоттингу окремо додавали MAG (n = 10, де n позначає кількість біологічно незалежних зразків комарів) та самок LRT (n = 30) від 4-денних незайманих самців та незайманих або примусово спарених самок (<10 після спарювання). Буфер для екстракції білка (50 мМ Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% дезоксихолату натрію; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1× коктейль інгібіторів протеаз (Roche)). Зразки гомогенізували одразу після дисекції за допомогою бісеру (скляні кульки 2 мм, 2400 об/хв, 90 сек). Нерозчинні залишки видаляли центрифугуванням при 20 000 g при 4 °C. Білки кількісно визначали за допомогою аналізу Бредфорда (Bio-Rad). Потім 20 мкг білка MAG, 40 мкг білка LRT та 20 мкг залишкового білка денатурували та розділяли на 10%... Біс-Трис NuPAGE з використанням MOPS-буфера. Білки переносили на полівініліденфторидні мембрани за допомогою системи перенесення iBlot2 (Thermo Fisher). Мембрани двічі промивали в 1× PBS-T (0,1% Tween-20 в PBS), а потім блокували в блокуючому буфері Odyssey (Li-Cor) протягом 1 години при 22°C. Мембрани струшували протягом ночі при 4°C з використанням спеціального поліклонального первинного антитіла кролика проти EPP (1:700 в блокуючому буфері) та моноклонального первинного антитіла щура проти актину MAC237 (Abeam; 1:4000). Мембрани промивали PBS-T, а потім інкубували з вторинними антитілами (ослине антитіло проти кролика 800CW та козяче антитіло проти щура 680LT (Li-Cor), обидва 1:20 000) у блокуючому буфері, що містив 0,01% SDS та 0,2% Tween-20 протягом 1 години при 22°C. Мембрани промивали PBS-T. та зображено за допомогою сканера Odyssey CLx. Зображення було зібрано та оброблено в Image Studio (версія 5.2). Специфічної смуги, що відповідає ізоформі EPP-RA (82 кДа), не було виявлено.
Кодуючі області EPP (як ізоформа AGAP002463-RB, що містить домен гістидинфосфатази, пошук консервативних доменів NCBI 34) та EcK2 (AGAP002181) були клоновані в плазміду pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); праймери наведено в розширеній таблиці даних 2. Вісім лінкерів GS4 (тандемно) були вставлені перед C-кінцевою міткою 6xHis конструкції pET-21a(+)-EcK2. Рекомбінантні білки були отримані за допомогою реакції синтезу білка E. coli без клітин NEBExpress (New England BioLabs). Рекомбінантні білки були очищені за допомогою спін-колонок NEBExpress Ni (New England BioLabs). Контрольний білок дигідрофолатредуктази (DHFR) був отриманий за допомогою ДНК-матриці з набору для синтезу білка E. coli без клітин NEBExpress. Білки зберігали в 50% гліцерині в PBS при -20 °C до 3 місяців.
Фосфатазну активність EPP та тканинних екстрактів вимірювали за допомогою 4-нітрофенілфосфату (pNPP; Sigma-Aldrich). Реакційний буфер містив 25 мМ Tris, 50 мМ оцтової кислоти, 25 мМ Bis-Tris, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA та 1 мМ DTT. Тканину гомогенізували в реакційному буфері, а клітинні залишки видаляли центрифугуванням. Ініціювали реакцію, додавши фермент або тканинний екстракт до реакційного буфера, що містить 2,5 мг/мл pNPP. Реакційну суміш інкубували при кімнатній температурі в темряві, а кількість pNP, перетвореного з pNPP, кількісно визначали, вимірюючи поглинання при 405 нм у різний час.
Для визначення активності EcK in vitro білок інкубували з 0,2 мг 20E або 3D20E у 200 мкл буфера (pH 7,5), що містив 10 мМ HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 мМ АТФ та 10 мМ MgCl2 протягом 2 годин при 27 °C. Реакцію зупиняли додаванням 800 мкл метанолу, потім охолоджували при -20 °C протягом 1 години, а потім центрифугували при 20 000 g протягом 10 хвилин при 4 °C. Потім супернатант аналізували за допомогою ВЕРХ-МС/МС. Для інактивації нагріванням білків, що використовувалися в контрольній групі, білки інкубували у 50% гліцерині в PBS протягом 20 хвилин при 95 °C.
Для визначення активності EPP in vitro білок інкубували з 3D20E22P (еквівалентно кількості, знайденій у 18 парах MAG, очищених за допомогою ВЕРХ-МС/МС) у 100 мкл буфера (pH 7,5), що містить 25 мМ Tris, 50 мМ оцтової кислоти, 25 мМ Bis-Tris, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA та 1 мМ DTT протягом 3 годин при 27 °C. Реакцію зупиняли додаванням 400 мкл метанолу та охолоджували при -20 °C протягом 1 години, потім центрифугували при 20 000 g протягом 10 хвилин при 4 °C. Супернатант аналізували за допомогою ВЕРХ-МС/МС.
ПЛР-фрагменти для EPP (362 п.н.), EcK1 (AGAP004574, 365 п.н.) та EcK2 (556 п.н.) були ампліфіковані з кДНК, отриманої з трупів комарів різної статі без голів. ПЛР-фрагмент контрольного eGFP (495 п.н.) був ампліфікований з раніше описаного pCR2.1-eGFP; ПЛР-праймери наведено в розширеній таблиці даних 2. ПЛР-фрагмент було вставлено між інвертованими промоторами T7 на плазміді pL4440. Плазмідні конструкції були отримані з компетентної NEB 5-α E. coli (New England Biolabs) та перевірені секвенуванням ДНК перед використанням (див. Додаткові дані 1 для послідовності вставки). Праймери, що відповідають промотору T7 (розширена таблиця даних 2), були використані для ампліфікації вставки з плазміди на основі pL4440. Розмір продукту ПЛР було підтверджено електрофорезом в агарозному гелі. dsRNA було транскрибовано з ПЛР-матриць за допомогою набору для транскрипції Megascript T7 (Thermo Fisher) та очищено згідно з інструкціями виробника з модифікаціями, описаними раніше.
Для ін'єкції dsRNA 1380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) вводили в концентрації 10 нг nl-1 у грудну клітку дорослих самців або самок (Nanoject III, Drummond) протягом 1 дня після ексклюзії. Рівні нокдауну генів визначали щонайменше в трьох біологічних повторностях шляхом екстракції РНК, синтезу кДНК та RT-qPCR. Для ін'єкції екдизону 4-денним або 6-денним самкам, яких годували кров'ю, вводили 0,13, 0,21 або 0,63 мкг 20E або 3D20E (Nanoject III, Drummond) у концентраціях 1,3, 2,1 відповідно, залежно від експериментального дизайну, або 6,3 нг nl-1. Вводили 100 нл 10% (об./об.) етанолу у воді; 100 нл 3D20E22P у 10% етанолі (еквівалентно 75% від кількості, виявленої в парі MAG). Комарів випадковим чином розподілили до групи ін'єкцій.
Для нерестових аналізів 3-денних самок годували людською кров'ю ad libitum. Видаляли частково нагодованих або ненагодованих комарів. Залежно від способу обробки, самок поміщали в окремі нерестові чашки на чотири ночі щонайменше через 48 годин після споживання крові. Яйця підраховували під стереоскопом (Stemi 508, Zeiss); у спарених самок яйця, з яких вилупилися личинки, вважали заплідненими.
Для випробувань на спарювання самкам давали щонайменше 2 дні, залежно від методу лікування, для розвитку стійкості до спарювання, а самців дикого типу відповідного віку згодом поміщали в ту саму клітку. Через дві ночі запліднені везикули самок препарували, а геномну ДНК вивільняли шляхом заморожування-відтавання та обробки ультразвуком у буфері, що містив 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA та 25 мМ NaCl (pH 8,2). Зразки інкубували з протеїназою K (0,86 мкг мкл-1) протягом 15 хвилин при 55 °C, а потім 10 хвилин при 95 °C. Препарати неочищеної геномної ДНК розводили в 10 разів та піддавали ПЛР-детектору послідовностей Y-хромосоми; праймери наведено в розширеній таблиці 2 даних. Відсутність послідовності Y-хромосоми вказує на відсутність спарювання.
Для аналізів повторного спарювання самок, яких примусово спарювали, досліджували на наявність парувальних пробок для підтвердження статусу спарювання та давали 2 дні для розвитку стійкості до спарювання за відсутності самців, як описано раніше36. Самців, які несли трансгенну сперму DsRed, потім вводили в клітки самок. Через дві ночі запліднюючі везикули вилучали з самок, готували геномну ДНК, як описано вище, та піддавали ПЛР-детектору трансгену DsRed; праймери наведено в розширеній таблиці даних 2. Відсутність трансгену DsRed свідчила про те, що повторного спарювання не відбулося.
3D20E був синтезований, як описано раніше37. Коротко, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) розчинили в 10 мл води, а потім додали 30 мг платинової чорноти (у формі порошку, Sigma-Aldrich). У реакційну суміш безперервно пропускали слабкий потік O2, яку перемішували при кімнатній температурі. Через 6 годин додали 30 мл метанолу для зупинки реакції. Суміш центрифугували для видалення частинок каталізатора. Супернатант випарювали насухо у вакуумі при кімнатній температурі. Висушений продукт реакції розчинили у 10% етанолі та метанолі для ін'єкцій для аналізу ВЕРХ-МС/МС. Коефіцієнт конверсії (від 20E до 3D20E) становив приблизно 97% (рис. 4b), а спектр МС синтезованого 3D20E відповідав спектру, виявленому у спарених самок (рис. 4c).
Легенда містить конкретні деталі проведених статистичних тестів. GraphPad (версія 9.0) використовувався для виконання точного тесту Фішера, тесту Мантеля-Кокса та t-тесту Стьюдента. Тести Кокрана-Мантеля-Хензеля проводилися за допомогою спеціального скрипта R (доступного за адресою https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Розподіл даних перевіряли на нормальність за допомогою тесту Шапіро-Вілка з порогом значущості 0,05. Коли дані не пройшли тест на нормальність, проводився тест Манна-Вітні. Дані виживання аналізували за допомогою тесту Мантеля-Кокса. Пакет DESeq2 (версія 1.28.1) використовувався для проведення аналізу диференціальної експресії на рівні генів RNA-seq. Горизонтальна смуга на графіку представляє медіану. Значення значущості P = 0,05 використовувалося як поріг для всіх тестів.
Для отримання додаткової інформації про дизайн дослідження див. анотацію до звіту про дослідження природи, посилання на яку наведено в цій статті.
Дані протеоміки MS були депоновані в консорціумі ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) через репозиторій партнера PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) з ідентифікатором набору даних PXD032157.
Набір даних RNA-seq зберігається в Комплексній бібліотеці експресії генів (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) під серійним записом GSE198665.
Додаткові набори даних, згенеровані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, можуть бути отримані від відповідних авторів за обґрунтованим запитом. У цій статті наведено вихідні дані.
Де Луф, А. Екдистероїди: занедбані статеві стероїди комах? Чоловічий: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гідроксиекдизон та розвиток яєчників у Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).