Пропіонова кислота (PPA), протигрибковий засіб і поширена харчова добавка, була показана як причина аномального нейророзвитку у мишей, що супроводжується шлунково-кишковою дисфункцією, яка може бути спричинена дисбактеріозом кишечника. Зв'язок між впливом PPA з їжею та дисбактеріозом кишкової мікробіоти був запропонований, але безпосередньо не досліджувався. Тут ми досліджували пов'язані з PPA зміни у складі кишкової мікробіоти, які можуть призвести до дисбактеріозу. Кишковий мікробіом мишей, яких годували необробленим раціоном (n=9) та раціоном, збагаченим PPA (n=13), секвенували за допомогою метагеномного секвенування з великим відстанню для оцінки відмінностей у мікробному складі та метаболічних шляхах бактерій. PPA з їжею була пов'язана зі збільшенням чисельності значущих таксонів, включаючи кілька видів Bacteroides, Prevotella та Ruminococcus, представники яких раніше були залучені до вироблення PPA. Мікробіоми мишей, які зазнали впливу PPA, також мали більше шляхів, пов'язаних з метаболізмом ліпідів та біосинтезом стероїдних гормонів. Наші результати показують, що PPA може змінювати кишкову мікробіоту та пов'язані з нею метаболічні шляхи. Ці спостережувані зміни підкреслюють, що консерванти, класифіковані як безпечні для споживання, можуть впливати на склад кишкової мікробіоти та, як наслідок, на здоров'я людини. Серед них P, G або S вибирається залежно від рівня класифікації, що аналізується. Щоб мінімізувати вплив хибнопозитивних класифікацій, було прийнято мінімальний поріг відносної чисельності 1e-4 (1/10 000 прочитань). Перед статистичним аналізом відносну чисельність, про яку повідомляв Брекен (fraction_total_reads), було перетворено за допомогою перетворення центрованого логарифмічного співвідношення (CLR) (Aitchison, 1982). Метод CLR було обрано для перетворення даних, оскільки він є масштабно-інваріантним і достатнім для нерозріджених наборів даних (Gloor et al., 2017). Перетворення CLR використовує натуральний логарифм. Дані підрахунку, про які повідомляв Брекен, було нормалізовано за допомогою відносного логарифмічного виразу (RLE) (Anders and Huber, 2010). Рисунки було згенеровано за допомогою комбінації matplotlib версії 3.7.1, seaborn версії 3.7.2 та послідовних логарифмів (Gloor et al., 2017). 0.12.2 та стантанотації версії 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Співвідношення Bacillus/Bacteroidetes було розраховано для кожного зразка з використанням нормалізованої кількості бактерій. Значення, наведені в таблицях, округлені до 4 знаків після коми. Індекс різноманітності Сімпсона було розраховано за допомогою скрипта alpha_diversity.py, що надається в пакеті KrakenTools версії 1.2 (Lu et al., 2022). Звіт Бракена надається у скрипті, а індекс Сімпсона «Si» надається для параметра -an. Значні відмінності в чисельності були визначені як середні відмінності CLR ≥ 1 або ≤ -1. Середня різниця CLR ±1 вказує на 2,7-кратне збільшення чисельності типу зразка. Знак (+/-) вказує, чи є таксон більш чисельним у зразку PPA та контрольному зразку відповідно. Значимість визначали за допомогою U-критерію Манна-Вітні (Virtanen et al., 2020). Використовували Statsmodels версії 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), а для корекції множинного тестування застосовували процедуру Бенджаміні-Хохберга. Як поріг для визначення статистичної значущості використовували скориговане p-значення ≤ 0,05.
Мікробіом людини часто називають «останнім органом тіла», і він відіграє життєво важливу роль у здоров'ї людини (Baquero and Nombela, 2012). Зокрема, кишковий мікробіом визнаний за його загальносистемний вплив та роль у багатьох важливих функціях. Коменсальні бактерії рясно поширені в кишечнику, займаючи численні екологічні ніші, використовуючи поживні речовини та конкуруючи з потенційними патогенами (Jandhyala et al., 2015). Різноманітні бактеріальні компоненти кишкової мікробіоти здатні виробляти необхідні поживні речовини, такі як вітаміни, та сприяти травленню (Rowland et al., 2018). Також було показано, що бактеріальні метаболіти впливають на розвиток тканин та посилюють метаболічні та імунні шляхи (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Склад кишкового мікробіома людини надзвичайно різноманітний і залежить від генетичних та екологічних факторів, таких як дієта, стать, ліки та стан здоров'я (Kumbhare et al., 2019).
Материнська дієта є критично важливим компонентом розвитку плода та новонародженого, а також ймовірним джерелом сполук, які можуть впливати на розвиток (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Однією з таких сполук, що становлять інтерес, є пропіонова кислота (PPA), побічний продукт коротколанцюгової жирної кислоти, отриманий в результаті бактеріальної ферментації, та харчова добавка (den Besten et al., 2013). PPA має антибактеріальні та протигрибкові властивості, тому використовується як консервант для харчових продуктів, а також у промислових застосуваннях для пригнічення росту цвілі та бактерій (Wemmenhove et al., 2016). PPA має різний вплив на різні тканини. У печінці PPA має протизапальну дію, впливаючи на експресію цитокінів у макрофагах (Kawasoe et al., 2022). Цей регуляторний ефект також спостерігався в інших імунних клітинах, що призводило до зниження регуляції запалення (Haase et al., 2021). Однак, протилежний ефект спостерігався в мозку. Попередні дослідження показали, що вплив PPA викликає аутичну поведінку у мишей (El-Ansary et al., 2012). Інші дослідження показали, що ППА може індукувати гліоз та активувати прозапальні шляхи в мозку (Abdelli et al., 2019). Оскільки ППА є слабкою кислотою, вона може дифундувати через кишковий епітелій у кровотік і таким чином долати обмежувальні бар'єри, включаючи гематоенцефалічний бар'єр, а також плаценту (Stinson et al., 2019), що підкреслює важливість ППА як регуляторного метаболіту, що виробляється бактеріями. Хоча потенційна роль ППА як фактора ризику аутизму наразі досліджується, її вплив на людей з аутизмом може виходити за рамки індукції нейронної диференціації.
Шлунково-кишкові симптоми, такі як діарея та запор, є поширеними у пацієнтів з нейророзвиточними розладами (Cao et al., 2021). Попередні дослідження показали, що мікробіом пацієнтів з розладами аутистичного спектру (РАС) відрізняється від мікробіому здорових людей, що свідчить про наявність дисбактеріозу кишкової мікробіоти (Finegold et al., 2010). Аналогічно, характеристики мікробіому пацієнтів із запальними захворюваннями кишечника, ожирінням, хворобою Альцгеймера тощо також відрізняються від характеристик здорових людей (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Однак на сьогоднішній день не встановлено причинно-наслідкового зв'язку між кишковим мікробіомом та неврологічними захворюваннями чи симптомами (Yap et al., 2021), хоча вважається, що кілька видів бактерій відіграють певну роль у деяких із цих хворобливих станів. Наприклад, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio та інші роди більш поширені в мікробіоті пацієнтів з аутизмом (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Примітно, що види деяких із цих родів, як відомо, мають гени, пов'язані з продукцією PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Враховуючи антимікробні властивості PPA, збільшення її кількості може бути корисним для росту бактерій, що продукують PPA (Jacobson et al., 2018). Таким чином, середовище, багате на PFA, може призвести до змін у кишковій мікробіоті, включаючи шлунково-кишкові патогени, що може бути потенційними факторами, що призводять до шлунково-кишкових симптомів.
Центральним питанням у дослідженні мікробіому є те, чи є відмінності в мікробному складі причиною чи симптомом основних захворювань. Першим кроком до з'ясування складного взаємозв'язку між дієтою, кишковим мікробіомом та неврологічними захворюваннями є оцінка впливу дієти на мікробний склад. З цією метою ми використовували метагеномне секвенування з довгим зчитуванням, щоб порівняти кишковий мікробіом потомства мишей, яких годували дієтою, багатою на ППА, або дієтою, збідненою на ППА. Потомство годували тим самим раціоном, що й їхні матері. Ми висунули гіпотезу, що дієта, багата на ППА, призведе до змін у мікробному складі кишечника та мікробних функціональних шляхах, особливо тих, що пов'язані з метаболізмом ППА та/або продукцією ППА.
У цьому дослідженні використовували трансгенних мишей FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), які надмірно експресують зелений флуоресцентний білок (GFP) під контролем гліально-специфічного промотора GFAP відповідно до рекомендацій Комітету з догляду та використання тварин Університету Центральної Флориди (UCF-IACUC) (номер дозволу на використання тварин: PROTO202000002). Після відлучення мишей розміщували окремо в клітках по 1–5 мишей кожної статі в кожній клітці. Мишей годували досхочу або очищеним контрольним раціоном (модифікований стандартний раціон відкритого типу, 16 ккал% жиру), або раціоном з додаванням пропіонату натрію (модифікований стандартний раціон відкритого типу, 16 ккал% жиру, що містить 5000 ppm пропіонату натрію). Кількість використаного пропіонату натрію була еквівалентна 5000 мг PFA/кг загальної ваги корму. Це найвища концентрація PPA, схвалена для використання як харчовий консервант. Для підготовки до цього дослідження батьківських мишей годували обома раціонами протягом 4 тижнів до спарювання та продовжували годувати протягом усієї вагітності матері. Потомства мишей [22 миші, 9 контрольних (6 самців, 3 самиці) та 13 мишей-потомків (4 самці, 9 самиць)] відлучили від матері, а потім продовжували годувати тим самим раціоном, що й матері, протягом 5 місяців. Потомства мишей умертвили у віці 5 місяців, їхній кишковий фекалій зібрали та спочатку зберігали в мікроцентрифужних пробірках об'ємом 1,5 мл при температурі -20°C, а потім перенесли в морозильну камеру при температурі -80°C до виснаження ДНК хазяїна та екстракції мікробних нуклеїнових кислот.
ДНК хазяїна видаляли згідно з модифікованим протоколом (Charalampous et al., 2019). Коротко кажучи, вміст калу переносили до 500 мкл InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) та зберігали замороженим. Обробляли максимум 1-2 калові гранули на одну екстракцію. Потім вміст калу механічно гомогенізували за допомогою пластикового маточки всередині пробірки для утворення суспензії. Центрифугували зразки при 10 000 RCF протягом 5 хвилин або доки зразки не осадилися, потім відсмоктували супернатант та ресуспендували осад у 250 мкл 1× PBS. Додавали 250 мкл 4,4% розчину сапоніну (TCI, номер продукту S0019) до зразка як детергент для розпушення мембран еукаріотичних клітин. Зразки обережно перемішували до однорідної маси та інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Далі, щоб зруйнувати еукаріотичні клітини, до зразка додали 350 мкл води, вільної від нуклеаз, інкубували протягом 30 секунд, а потім додали 12 мкл 5 M NaCl. Потім зразки центрифугували при 6000 RCF протягом 5 хвилин. Відсмоктайте супернатант та ресуспендуйте осад у 100 мкл 1X PBS. Щоб видалити ДНК хазяїна, додайте 100 мкл буфера HL-SAN (12,8568 г NaCl, 4 мл 1M MgCl2, 36 мл води, вільної від нуклеаз) та 10 мкл ферменту HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Зразки ретельно перемішали піпеткою та інкубували при 37 °C протягом 30 хвилин при 800 об/хв на термоміксері Eppendorf™ ThermoMixer C. Після інкубації центрифугували при 6000 RCF протягом 3 хвилин та двічі промивали 800 мкл та 1000 мкл 1X PBS. Нарешті, осад ресуспендували у 100 мкл 1X PBS.
Загальну бактеріальну ДНК виділяли за допомогою набору для очищення геномної ДНК Monarch від New England Biolabs (New England Biolabs, Іпсвіч, Массачусетс, кат. № T3010L). Стандартна операційна процедура, що постачається з набором, дещо змінена. Інкубуйте та підтримуйте воду, вільну від нуклеаз, при температурі 60°C перед операцією для остаточного елюювання. Додайте 10 мкл протеїнази К та 3 мкл РНКази А до кожного зразка. Потім додайте 100 мкл буфера для лізису клітин та обережно перемішайте. Зразки інкубували в термоміксері Eppendorf™ ThermoMixer C при 56°C та 1400 об/хв протягом щонайменше 1 години та до 3 годин. Інкубовані зразки центрифугували при 12 000 RCF протягом 3 хвилин, а супернатант з кожного зразка переносили в окрему мікроцентрифужну пробірку об'ємом 1,5 мл, що містила 400 мкл розчину для зв'язування. Потім пробірки імпульсно перемішували на вортексі протягом 5–10 секунд з інтервалом у 1 секунду. Перенесіть весь рідкий вміст кожного зразка (приблизно 600–700 мкл) у фільтрувальний картридж, поміщений у проточну пробірку для збору. Пробірки центрифугували при 1000 RCF протягом 3 хвилин, щоб забезпечити початкове зв'язування ДНК, а потім центрифугували при 12 000 RCF протягом 1 хвилини для видалення залишків рідини. Колонку зі зразком перенесли в нову пробірку для збору, а потім промили двічі. Для першого промивання додайте 500 мкл промивного буфера в кожну пробірку. Переверніть пробірку 3–5 разів, а потім центрифугуйте при 12 000 RCF протягом 1 хвилини. Злийте рідину з пробірки для збору та помістіть фільтрувальний картридж назад у ту саму пробірку для збору. Для другого промивання додайте 500 мкл промивного буфера до фільтра, не перевертаючи. Зразки центрифугували при 12 000 RCF протягом 1 хвилини. Перенесіть фільтр у пробірку LoBind® об'ємом 1,5 мл та додайте 100 мкл попередньо підігрітої води, вільної від нуклеаз. Фільтри інкубували при кімнатній температурі протягом 1 хвилини, а потім центрифугували при 12 000 RCF протягом 1 хвилини. Елюйовану ДНК зберігали при -80°C.
Концентрацію ДНК кількісно визначали за допомогою флуорометра Qubit™ 4.0. ДНК готували за допомогою набору Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (кат. № Q33231) згідно з інструкціями виробника. Розподіл довжини фрагментів ДНК вимірювали за допомогою Aglient™ 4150 або 4200 TapeStation. ДНК готували за допомогою реагентів Agilent™ Genomic DNA Reagents (кат. № 5067-5366) та Genomic DNA ScreenTape (кат. № 5067-5365). Підготовку бібліотеки проводили за допомогою набору Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) згідно з інструкціями виробника. ДНК секвенували за допомогою секвенатора ONT GridION™ Mk1 з проточною коміркою Min106D (R 9.4.1). Налаштування секвенування були: високоточне визначення основ, мінімальне значення q 9, налаштування штрих-коду та обрізання штрих-коду. Зразки секвенували протягом 72 годин, після чого дані базового виклику були надіслані для подальшої обробки та аналізу.
Біоінформаційну обробку виконували з використанням раніше описаних методів (Greenman et al., 2024). Файли FASTQ, отримані в результаті секвенування, були розділені на каталоги для кожного зразка. Перед біоінформаційним аналізом дані обробляли за допомогою наступного конвеєра: спочатку файли FASTQ зразків об'єднували в один файл FASTQ. Потім, зчитування коротше 1000 bp фільтрували за допомогою Filtlong версії 0.2.1, при цьому єдиним зміненим параметром було –min_length 1000 (Wick, 2024). Перед подальшою фільтрацією якість зчитування контролювали за допомогою NanoPlot версії 1.41.3 з такими параметрами: –fastq –plots dot –N50 -o
Для таксономічної класифікації, зчитування та зібрані контиги були класифіковані за допомогою Kraken2 версії 2.1.2 (Wood et al., 2019). Генеруйте звіти та вихідні файли для зчитувань та збірок відповідно. Використовуйте параметр –use-names для аналізу зчитувань та збірок. Для сегментів зчитування вказані параметри –gzip-compressed та –paired. Відносну чисельність таксонів у метагеномах оцінювали за допомогою Bracken версії 2.8 (Lu et al., 2017). Спочатку ми створили базу даних kmer, що містить 1000 баз, за допомогою bracken-build з такими параметрами: -d
Анотацію генів та оцінку відносної чисельності виконували за допомогою модифікованої версії протоколу, описаного Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Спочатку контиги довжиною менше 500 п.н. видаляли з усіх збірок за допомогою SeqKit версії 2.5.1 (Shen et al., 2016). Потім вибрані збірки об'єднували в пан-метагеном. Відкриті рамки зчитування (ORF) ідентифікували за допомогою Prodigal версії 1.0.1 (паралельної версії Prodigal версії 2.6.3) з такими параметрами: -d
Спочатку гени групували відповідно до ортологічних (KO) ідентифікаторів Кіотської енциклопедії генів та геномів (KEGG), призначених eggNOG, для порівняння кількості генних шляхів. Гени без нокаутів або гени з множинними нокаутами видаляли перед аналізом. Потім розраховували середню кількість кожного KO на зразок та проводили статистичний аналіз. Гени метаболізму PPA визначали як будь-який ген, якому було призначено рядок ko00640 у стовпці KEGG_Pathway, що вказує на роль у метаболізмі пропіонату згідно з KEGG. Гени, ідентифіковані як пов'язані з продукцією PPA, перелічені в Додатковій таблиці 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Були проведені перестановочні тести для ідентифікації генів метаболізму та продукції PPA, які були значно більш поширеними в кожному типі зразка. Для кожного проаналізованого гена було виконано тисячу перестановок. p-значення 0,05 використовувалося як порогове значення для визначення статистичної значущості. Функціональні анотації були призначені окремим генам у кластері на основі анотацій репрезентативних генів у кластері. Таксони, пов'язані з метаболізмом PPA та/або продукцією PPA, можна було ідентифікувати шляхом зіставлення ідентифікаторів контигів у вихідних файлах Kraken2 з тими ж ідентифікаторами контигів, що збереглися під час функціональної анотації за допомогою eggNOG. Перевірку значущості проводили за допомогою U-критерію Манна-Вітні, описаного раніше. Корекцію на множинне тестування проводили за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга. p-значення ≤ 0,05 використовували як порогове значення для визначення статистичної значущості.
Різноманітність кишкового мікробіому мишей оцінювали за допомогою індексу різноманітності Сімпсона. Не спостерігалося суттєвих відмінностей між контрольними зразками та зразками PPA з точки зору родового та видового різноманіття (p-значення для роду: 0,18, p-значення для виду: 0,16) (Рисунок 1). Потім мікробний склад порівнювали за допомогою аналізу головних компонентів (PCA). На рисунку 2 показано кластеризацію зразків за їхніми типами, що вказує на наявність відмінностей у видовому складі мікробіомів між зразками PPA та контрольними зразками. Ця кластеризація була менш вираженою на рівні роду, що свідчить про вплив PPA на певні бактерії (Додатковий рис. 1).
Рисунок 1. Альфа-різноманітність родів та видовий склад мікробіома кишечника миші. Коробчасті діаграми, що показують індекси різноманітності Сімпсона родів (A) та видів (B) у PPA та контрольних зразках. Значимість визначали за допомогою U-критерію Манна-Вітні, а множинну корекцію проводили за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга. ns, p-значення не було значущим (p>0,05).
Рисунок 2. Результати аналізу головних компонентів складу мікробіома кишечника мишей на видовому рівні. Графік аналізу головних компонентів відображає розподіл зразків за їхніми першими двома головними компонентами. Кольори вказують на тип зразка: миші, що зазнали впливу PPA, позначені фіолетовим кольором, а контрольні миші – жовтим. Головні компоненти 1 та 2 відкладені на осі x та осі y відповідно та виражені як їх пояснене коефіцієнт дисперсії.
Використовуючи трансформовані дані підрахунку RLE, спостерігалося значне зниження медіанного співвідношення Bacteroidetes/Bacilli у контрольних мишей та мишей PPA (контроль: 9,66, PPA: 3,02; p-значення = 0,0011). Ця різниця була зумовлена більшою чисельністю Bacteroidetes у мишей PPA порівняно з контрольними, хоча різниця не була суттєвою (середнє значення CLR у контролі: 5,51, середнє значення CLR у PPA: 6,62; p-значення = 0,054), тоді як чисельність Bacteroidetes була подібною (середнє значення CLR у контролі: 7,76, середнє значення CLR у PPA: 7,60; p-значення = 0,18).
Аналіз чисельності таксономічних членів кишкового мікробіома показав, що 1 тип та 77 видів суттєво відрізнялися між зразками PPA та контрольними зразками (Додаткова таблиця 2). Чисельність 59 видів у зразках PPA була значно вищою, ніж у контрольних зразках, тоді як чисельність лише 16 видів у контрольних зразках була вищою, ніж у зразках PPA (Рисунок 3).
Рисунок 3. Різниця в чисельності таксонів у кишковому мікробіомі мишей PPA та контрольної групи. Діаграми вулканів показують відмінності в чисельності родів (A) або видів (B) між зразками PPA та контрольною групою. Сірі точки вказують на відсутність суттєвої різниці в чисельності таксонів. Кольорові точки вказують на значні відмінності в чисельності (p-значення ≤ 0,05). 20 найкращих таксонів з найбільшими відмінностями в чисельності між типами зразків показані червоним та світло-синім кольором (контрольні зразки та зразки PPA) відповідно. Жовті та фіолетові точки були щонайменше в 2,7 раза більш чисельними в контрольних зразках або зразках PPA, ніж у контрольних. Чорні точки представляють таксони зі суттєво різною чисельністю, із середніми відмінностями CLR від -1 до 1. Значення P були розраховані за допомогою U-критерію Манна-Вітні та скориговані для багаторазового тестування за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга. Виділені жирним шрифтом середні відмінності CLR вказують на значні відмінності в чисельності.
Після аналізу мікробного складу кишечника ми провели функціональну анотацію мікробіому. Після фільтрації генів низької якості, загалом у всіх зразках було ідентифіковано 378 355 унікальних генів. Трансформовану кількість цих генів було використано для аналізу головних компонентів (PCA), і результати показали високий ступінь кластеризації типів зразків на основі їх функціональних профілів (Рисунок 4).
Рисунок 4. Результати PCA з використанням функціонального профілю кишкового мікробіома миші. Графік PCA відображає розподіл зразків за їхніми першими двома головними компонентами. Кольори вказують на тип зразка: миші, що зазнали впливу PPA, позначені фіолетовим кольором, а контрольні миші – жовтим. Головні компоненти 1 та 2 відкладені на осі x та осі y відповідно та виражені як їх пояснене коефіцієнт дисперсії.
Далі ми дослідили кількість нокаутів KEGG у різних типах зразків. Загалом було виявлено 3648 унікальних нокаутів, з яких 196 були значно більш поширеними в контрольних зразках, а 106 – у зразках PPA (Рисунок 5). Загалом у контрольних зразках було виявлено 145 генів, а у зразках PPA – 61 ген, зі значно різною кількістю. Шляхи, пов'язані з метаболізмом ліпідів та аміноцукрів, були значно більш збагачені у зразках PPA (Додаткова таблиця 3). Шляхи, пов'язані з метаболізмом азоту та системами ретрансляції сірки, були значно більш збагачені в контрольних зразках (Додаткова таблиця 3). Кількість генів, пов'язаних з метаболізмом аміноцукрів/нуклеотидів (ko:K21279) та метаболізмом інозитолфосфату (ko:K07291), була значно вищою у зразках PPA (Рисунок 5). Контрольні зразки мали значно більше генів, пов'язаних з метаболізмом бензоату (ko:K22270), метаболізмом азоту (ko:K00368) та гліколізом/глюконеогенезом (ko:K00131) (Рисунок 5).
Рис. 5. Диференціальна чисельність KO у кишковому мікробіомі мишей PPA та контрольної групи. Вулканічна діаграма зображує відмінності в чисельності функціональних груп (KO). Сірі точки вказують на KO, чисельність яких суттєво не відрізнялася між типами зразків (p-значення > 0,05). Кольорові точки вказують на значні відмінності в чисельності (p-значення ≤ 0,05). 20 KO з найбільшими відмінностями в чисельності між типами зразків показані червоним та світло-синім кольором, що відповідає контрольним зразкам та зразкам PPA відповідно. Жовті та фіолетові точки вказують на KO, які були щонайменше в 2,7 раза більш поширені в контрольних зразках та зразках PPA відповідно. Чорні точки вказують на KO зі значно різною чисельністю, із середніми відмінностями CLR від -1 до 1. Значення P були розраховані за допомогою U-критерію Манна-Вітні та скориговані для множинних порівнянь за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга. NaN вказує на те, що KO не належить до шляху в KEGG. Жирним шрифтом виділені середні значення різниці CLR вказують на значні відмінності в чисельності. Для отримання детальної інформації про шляхи, до яких належать перелічені KO, див. Додаткову таблицю 3.
Серед анотованих генів 1601 ген мав суттєво різну кількість між типами зразків (p ≤ 0,05), причому кожен ген був щонайменше в 2,7 раза більш поширеним. З цих генів 4 гени були більш поширеними в контрольних зразках, а 1597 генів були більш поширеними у зразках PPA. Оскільки PPA має антимікробні властивості, ми дослідили кількість генів метаболізму та продукції PPA між типами зразків. Серед 1332 генів, пов'язаних з метаболізмом PPA, 27 генів були значно більш поширеними в контрольних зразках, а 12 генів були більш поширеними у зразках PPA. Серед 223 генів, пов'язаних з продукцією PPA, 1 ген був значно більш поширеним у зразках PPA. Рисунок 6A додатково демонструє вищу кількість генів, задіяних у метаболізмі PPA, зі значно вищою кількістю в контрольних зразках та великими розмірами ефекту, тоді як Рисунок 6B виділяє окремі гени зі значно вищою кількістю, що спостерігається у зразках PPA.
Рис. 6. Диференціальна чисельність генів, пов'язаних з PPA, у мікробіомі кишечника миші. Вулканічні діаграми зображують відмінності в чисельності генів, пов'язаних з метаболізмом PPA (A) та продукцією PPA (B). Сірі точки вказують на гени, чисельність яких суттєво не відрізнялася між типами зразків (p-значення > 0,05). Кольорові точки вказують на значні відмінності в чисельності (p-значення ≤ 0,05). 20 генів з найбільшими відмінностями в чисельності показані червоним та світло-синім кольором (контрольні зразки та зразки PPA) відповідно. Чисельність жовтих та фіолетових точок була щонайменше в 2,7 раза більшою в контрольних зразках та зразках PPA, ніж у контрольних зразках. Чорні точки представляють гени зі суттєво різною чисельністю, із середніми відмінностями CLR від -1 до 1. Значення P були розраховані за допомогою U-критерію Манна-Вітні та скориговані для множинних порівнянь за допомогою процедури Бенджаміні-Хохберга. Гени відповідають репрезентативним генам у ненадлишковому каталозі генів. Назви генів складаються з символу KEGG, що позначає ген KO. Виділені жирним шрифтом середні відмінності CLR вказують на суттєво різну чисельність. Тире (-) вказує на те, що в базі даних KEGG немає символу для цього гена.
Таксони з генами, пов'язаними з метаболізмом та/або продукцією PPA, були ідентифіковані шляхом зіставлення таксономічної ідентичності контигів з ідентифікатором контига гена. На рівні роду було виявлено, що 130 родів мають гени, пов'язані з метаболізмом PPA, та 61 рід має гени, пов'язані з продукцією PPA (Додаткова таблиця 4). Однак жоден рід не показав суттєвих відмінностей у чисельності (p > 0,05).
На видовому рівні було виявлено 144 види бактерій, які мають гени, пов'язані з метаболізмом PPA, та 68 видів бактерій, які мають гени, пов'язані з продукцією PPA (Додаткова таблиця 5). Серед метаболізаторів PPA вісім бактерій продемонстрували значне збільшення чисельності між типами зразків, і всі вони показали значні зміни в ефекті (Додаткова таблиця 6). Усі ідентифіковані метаболізатори PPA зі значними відмінностями в чисельності були більш поширеними у зразках PPA. Класифікація на видовому рівні виявила представників родів, які суттєво не відрізнялися між типами зразків, включаючи кілька видів Bacteroides та Ruminococcus, а також Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus та Alcaligenes polymorpha. Серед бактерій, що продукують PPA, чотири бактерії продемонстрували значні відмінності в чисельності між типами зразків. Види зі значними відмінностями в чисельності включали Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis та Ruminococcus bovis.
У цьому дослідженні ми вивчили вплив впливу PPA на кишкову мікробіоту мишей. PPA може викликати різні реакції у бактерій, оскільки вона виробляється певними видами, використовується як джерело їжі іншими видами або має антимікробну дію. Тому її додавання до кишкового середовища за допомогою харчових добавок може мати різні ефекти залежно від толерантності, сприйнятливості та здатності використовувати її як джерело поживних речовин. Чутливі види бактерій можуть бути виключені та замінені тими, які більш стійкі до PPA або здатні використовувати її як джерело їжі, що призводить до змін у складі кишкової мікробіоти. Наші результати виявили значні відмінності в мікробному складі, але не впливали на загальне мікробне різноманіття. Найбільший вплив спостерігався на видовому рівні, причому понад 70 таксонів суттєво відрізнялися за чисельністю між PPA та контрольними зразками (Додаткова таблиця 2). Подальша оцінка складу зразків, що зазнали впливу PPA, виявила більшу гетерогенність мікробних видів порівняно з неекспонованими зразками, що свідчить про те, що PPA може посилювати характеристики росту бактерій та обмежувати популяції бактерій, які можуть виживати в середовищах, багатих на PPA. Таким чином, PPA може вибірково індукувати зміни, а не спричиняти широкомасштабне порушення різноманітності кишкової мікробіоти.
Раніше було показано, що харчові консерванти, такі як PPA, змінюють чисельність компонентів кишкового мікробіома, не впливаючи на загальну різноманітність (Nagpal et al., 2021). Тут ми спостерігали найвражаючі відмінності між видами Bacteroidetes у межах типу Bacteroidetes (раніше відомих як Bacteroidetes), які були значно збагачені у мишей, які зазнали впливу PPA. Збільшена чисельність видів Bacteroides пов'язана зі збільшенням розпаду слизу, що може збільшити ризик інфекції та сприяти запаленню (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Одне дослідження показало, що новонароджені самці мишей, яких лікували Bacteroides fragilis, демонстрували соціальну поведінку, що нагадує розлад аутистичного спектру (РАС) (Carmel et al., 2023), а інші дослідження показали, що види Bacteroides можуть змінювати імунну активність і призводити до аутоімунної запальної кардіоміопатії (Gil-Cruz et al., 2019). Види, що належать до родів Ruminococcus, Prevotella та Parabacteroides, також значно збільшилися у мишей, які зазнали впливу PPA (Coretti et al., 2018). Деякі види Ruminococcus пов'язані з такими захворюваннями, як хвороба Крона, через продукцію прозапальних цитокінів (Henke et al., 2019), тоді як види Prevotella, такі як Prevotella humani, пов'язані з метаболічними захворюваннями, такими як гіпертензія та чутливість до інсуліну (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Нарешті, ми виявили, що співвідношення Bacteroidetes (раніше відомих як Firmicutes) до Bacteroidetes було значно нижчим у мишей, які зазнали впливу PPA, ніж у контрольних мишей через вищу загальну чисельність видів Bacteroidetes. Раніше було показано, що це співвідношення є важливим показником кишкового гомеостазу, і порушення цього співвідношення пов'язують з різними захворюваннями (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), включаючи запальні захворювання кишечника (Stojanov et al., 2020). Загалом, види типу Bacteroidetes, здається, найбільше зазнають впливу підвищеного рівня PPA в раціоні. Це може бути пов'язано з вищою толерантністю до PPA або здатністю використовувати PPA як джерело енергії, що, як було показано, вірно принаймні для одного виду, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Як альтернатива, вплив PPA на материнську м'язову залозу може посилити розвиток плода, роблячи кишечник потомства мишей більш сприйнятливим до колонізації Bacteroidetes; однак, дизайн нашого дослідження не дозволив провести таку оцінку.
Метагеномна оцінка вмісту виявила значні відмінності в кількості генів, пов'язаних з метаболізмом та продукцією PPA, причому миші, які отримували PPA, демонстрували вищу кількість генів, відповідальних за продукцію PPA, тоді як миші, які не отримували PPA, демонстрували вищу кількість генів, відповідальних за метаболізм PAA (Рисунок 6). Ці результати свідчать про те, що вплив PPA на мікробний склад може бути не виключно зумовлений його використанням, інакше кількість генів, пов'язаних з метаболізмом PPA, мала б показати вищу кількість у кишковому мікробіомі мишей, які отримували PPA. Одним із пояснень є те, що PPA опосередковує кількість бактерій головним чином через свою антимікробну дію, а не через її використання бактеріями як поживної речовини. Попередні дослідження показали, що PPA пригнічує ріст Salmonella Typhimurium дозозалежним чином (Jacobson et al., 2018). Вплив вищих концентрацій PPA може сприяти відбору бактерій, стійких до її антимікробних властивостей, які не обов'язково можуть метаболізувати або продукувати її. Наприклад, кілька видів Parabacteroides показали значно вищу чисельність у зразках PPA, але не було виявлено генів, пов'язаних з метаболізмом або продукцією PPA (Додаткові таблиці 2, 4 та 5). Крім того, продукція PPA як побічного продукту ферментації широко поширена серед різних бактерій (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Більша бактеріальна різноманітність може бути причиною більшої чисельності генів, пов'язаних з метаболізмом PPA, у контрольних зразках (Averina et al., 2020). Крім того, було передбачено, що лише 27 (2,14%) з 1332 генів пов'язані виключно з метаболізмом PPA. Багато генів, пов'язаних з метаболізмом PPA, також беруть участь в інших метаболічних шляхах. Це додатково демонструє, що чисельність генів, задіяних у метаболізмі PPA, була вищою в контрольних зразках; ці гени можуть функціонувати в шляхах, які не призводять до утилізації або утворення PPA як побічного продукту. У цьому випадку лише один ген, пов'язаний з утворенням PPA, показав значні відмінності в чисельності між типами зразків. На відміну від генів, пов'язаних з метаболізмом PPA, маркерні гени для продукції PPA були відібрані, оскільки вони безпосередньо залучені до бактеріального шляху продукції PPA. У мишей, що зазнали впливу PPA, у всіх видів було виявлено значне збільшення чисельності та здатності до продукції PPA. Це підтверджує припущення, що PPA відбиратимуть продуцентів PPA і, отже, прогнозуватимуть збільшення виробничої здатності PPA. Однак, чисельність генів не обов'язково корелює з експресією генів; таким чином, хоча чисельність генів, пов'язаних з метаболізмом PPA, вища в контрольних зразках, швидкість експресії може бути іншою (Shi et al., 2014). Щоб підтвердити зв'язок між поширеністю генів, що продукують PPA, та продукцією PPA, необхідні дослідження експресії генів, що беруть участь у виробництві PPA.
Функціональна анотація метагеномів PPA та контрольних метагеномів виявила деякі відмінності. PCA-аналіз вмісту генів виявив дискретні кластери між PPA та контрольними зразками (Рисунок 5). Кластеризація в межах зразків показала, що вміст генів у контрольних зразках був більш різноманітним, тоді як зразки PPA кластеризувалися разом. Кластеризація за вмістом генів була порівнянною з кластеризацією за видовим складом. Таким чином, відмінності в чисельності шляхів узгоджуються зі змінами в чисельності конкретних видів та штамів у них. У зразках PPA два шляхи зі значно вищою чисельністю були пов'язані з метаболізмом аміноцукрів/нуклеотидів (ko:K21279) та кількома шляхами метаболізму ліпідів (ko:K00647, ko:K03801; Додаткова таблиця 3). Відомо, що гени, пов'язані з ko:K21279, пов'язані з родом Bacteroides, одним з родів зі значно більшою кількістю видів у зразках PPA. Цей фермент може уникати імунної відповіді, експресуючи капсульні полісахариди (Wang et al., 2008). Це може пояснювати збільшення кількості Bacteroidetes, що спостерігається у мишей, які зазнали впливу PPA. Це доповнює підвищений синтез жирних кислот, що спостерігається в мікробіомі PPA. Бактерії використовують шлях FASIIko:K00647 (fabB) для продукування жирних кислот, які можуть впливати на метаболічні шляхи хазяїна (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), а зміни в метаболізмі ліпідів можуть відігравати певну роль у нейророзвитку (Yu et al., 2020). Іншим шляхом, що демонструє підвищену кількість у зразках PPA, був біосинтез стероїдних гормонів (ko:K12343). З'являється все більше доказів того, що існує зворотна залежність між здатністю кишкової мікробіоти впливати на рівень гормонів та зазнавати впливу гормонів, так що підвищений рівень стероїдів може мати наслідки для здоров'я (Tetel et al., 2018).
Це дослідження не позбавлене обмежень та міркувань. Важливою відмінністю є те, що ми не проводили фізіологічних оцінок тварин. Тому неможливо безпосередньо зробити висновок про те, чи пов'язані зміни в мікробіомі з будь-яким захворюванням. Ще одним міркуванням є те, що мишей у цьому дослідженні годували тим самим раціоном, що й їхніх матерів. Майбутні дослідження можуть визначити, чи покращує перехід з раціону, багатого на PPA, на раціон без PPA його вплив на мікробіом. Одним з обмежень нашого дослідження, як і багатьох інших, є обмежений розмір вибірки. Хоча можна зробити обґрунтовані висновки, більший розмір вибірки забезпечив би більшу статистичну потужність при аналізі результатів. Ми також обережно ставимося до висновків щодо зв'язку між змінами в кишковому мікробіомі та будь-яким захворюванням (Yap et al., 2021). Змішувальні фактори, включаючи вік, стать та дієту, можуть суттєво впливати на склад мікроорганізмів. Ці фактори можуть пояснити невідповідності, що спостерігаються в літературі щодо зв'язку кишкового мікробіома зі складними захворюваннями (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Наприклад, було показано, що у тварин і людей з РАС спостерігається або збільшення, або зменшення кількості представників роду Bacteroidetes (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Аналогічно, дослідження складу кишечника у пацієнтів із запальними захворюваннями кишечника виявили як збільшення, так і зменшення кількості тих самих таксонів (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Щоб обмежити вплив гендерної упередженості, ми намагалися забезпечити рівне представництво статей, щоб відмінності, найімовірніше, були зумовлені дієтою. Однією з проблем функціональної анотації є видалення надлишкових послідовностей генів. Наш метод кластеризації генів вимагає 95% ідентичності послідовностей та 85% подібності довжини, а також 90% покриття вирівнювання для усунення хибної кластеризації. Однак у деяких випадках ми спостерігали COG з однаковими анотаціями (наприклад, MUT) (рис. 6). Потрібні подальші дослідження, щоб визначити, чи є ці ортологи різними, пов'язаними з певними родами, чи це обмеження підходу кластеризації генів. Ще одним обмеженням функціональної анотації є потенційна неправильна класифікація; бактеріальний ген mmdA є відомим ферментом, що бере участь у синтезі пропіонату, але KEGG не пов'язує його з метаболічним шляхом пропіонату. Навпаки, ортологи scpB та mmcD є спорідненими. Велика кількість генів без позначених нокаутів може призвести до неможливості ідентифікувати гени, пов'язані з PPA, під час оцінки чисельності генів. Майбутні дослідження виграють від аналізу метатранскриптомів, який може забезпечити глибше розуміння функціональних характеристик кишкової мікробіоти та пов'язати експресію генів з потенційними наслідками. Для досліджень, що стосуються специфічних нейророзвиткових розладів або запальних захворювань кишечника, необхідні фізіологічні та поведінкові оцінки тварин, щоб пов'язати зміни у складі мікробіома з цими розладами. Додаткові дослідження з пересадкою кишкового мікробіома мишам, вільним від мікробів, також були б корисними для визначення того, чи є мікробіом рушійною силою чи характеристикою захворювання.
Підсумовуючи, ми продемонстрували, що харчова PPA діє як фактор, що змінює склад кишкової мікробіоти. PPA – це консервант, схвалений FDA, який широко міститься в різних продуктах харчування, і при тривалому впливі може призвести до порушення нормальної кишкової флори. Ми виявили зміни в чисельності кількох бактерій, що свідчить про те, що PPA може впливати на склад кишкової мікробіоти. Зміни в мікробіоті можуть призвести до змін рівнів певних метаболічних шляхів, що може призвести до фізіологічних змін, що мають значення для здоров'я організму. Необхідні подальші дослідження, щоб визначити, чи може вплив харчової PPA на мікробний склад призвести до дисбактеріозу або інших захворювань. Це дослідження закладає основу для майбутніх досліджень того, як вплив PPA на склад кишечника може впливати на здоров'я людини.
Набори даних, представлені в цьому дослідженні, доступні в онлайн-репозиторіях. Назва репозиторію та номер доступу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Це дослідження на тваринах було схвалено Комітетом з догляду за тваринами та їх використання Університету Центральної Флориди (UCF-IACUC) (номер дозволу на використання тварин: PROTO202000002). Це дослідження відповідає місцевим законам, нормам та інституційним вимогам.
НГ: Концептуалізація, Курування даних, Формальний аналіз, Дослідження, Методологія, Програмне забезпечення, Візуалізація, Написання (оригінальний чернетка), Написання (перегляд та редагування). ЛА: Концептуалізація, Курування даних, Методологія, Ресурси, Написання (перегляд та редагування). SH: Формальний аналіз, Програмне забезпечення, Написання (перегляд та редагування). SA: Дослідження, Написання (перегляд та редагування). Головний суддя: Дослідження, Написання (перегляд та редагування). SN: Концептуалізація, Адміністрування проєкту, Ресурси, Нагляд, Написання (перегляд та редагування). TA: Концептуалізація, Адміністрування проєкту, Нагляд, Написання (перегляд та редагування).
Автори заявили, що не отримували жодної фінансової підтримки для дослідження, написання та/або публікації цієї статті.
Автори заявляють, що дослідження проводилося за відсутності будь-яких комерційних чи фінансових відносин, які можна було б тлумачити як потенційний конфлікт інтересів. не застосовується.
Усі думки, висловлені в цій статті, належать виключно авторам і не обов'язково відображають погляди їхніх установ, видавців, редакторів чи рецензентів. Будь-які продукти, оцінені в цій статті, або будь-які заяви, зроблені їх виробниками, не гарантуються та не схвалюються видавцем.
Додаткові матеріали до цієї статті можна знайти онлайн: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абделлі Л.С., Самсам А., Нассер С.А. (2019). Пропіонова кислота індукує гліоз та нейрозапалення шляхом регулювання шляху PTEN/AKT при розладах аутистичного спектру. Наукові звіти 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Айчісон, Дж. (1982). Статистичний аналіз даних про склад. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Дж., Квон Х., Кім Ю. Дж. (2023). Співвідношення Firmicutes/Bacteroidetes як фактор ризику раку молочної залози. Журнал клінічної медицини, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Хубер В. (2010). Диференціальний аналіз експресії даних підрахунку послідовностей. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Анджеліс, М.Д., Пікколо, М., Ванніні, Л., Сірагуса, С., Джакомо, А.Д., Серрацанетті, Д.І. та ін. (2013). Фекальна мікробіота та метаболом у дітей з аутизмом та поширеним розладом розвитку, невказаною інше. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверіна О.В., Ковтун А.С., Полякова С.І., Савілова А.М., Ребріков Д.В., Даниленко В.Н. (2020). Бактеріальні нейрометаболічні характеристики кишкової мікробіоти у дітей раннього віку з розладами аутистичного спектру. Журнал медичної мікробіології 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Мікробіом як орган людини. Клінічна мікробіологія та інфекція 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дюрре П. (2023). Нові дослідження фізіології бактерій, що продукують пропіонову кислоту: Anaerotignum propionicum та Anaerotignum neopropionicum (раніше Clostridium propionicum та Clostridium neopropionicum). Мікроорганізми 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Харчування матері та розвиток плода. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Бенджаміні, Ю. та Хохберг, Дж. (1995). Контроль рівня хибнопозитивних результатів: практичний та ефективний підхід до багаторазового тестування. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Час публікації: 18 квітня 2025 р.