Імуномодулюючі метаболіти є ключовою характеристикою пухлинного мікрооточення (ПММО), але, за деякими винятками, їх ідентичність залишається значною мірою невідомою. Тут ми проаналізували пухлини та Т-клітини з пухлин та асциту пацієнтів з високодиференційованою серозною карциномою (ВГСК), щоб виявити метаболом цих різних компартментів ПММО. Асцит та пухлинні клітини мають значні відмінності в метаболітах. Порівняно з асцитом, пухлиноінфільтруючі Т-клітини значно збагачені 1-метилнікотинамідом (МНА). Хоча рівень МНА в Т-клітинах підвищений, експресія нікотинамід-N-метилтрансферази (ферменту, що каталізує перенесення метильних груп від S-аденозилметіоніну до нікотинаміду) обмежується фібробластами та пухлинними клітинами. Функціонально МНА індукує Т-клітини секрецію пухлино-стимулюючого цитокіну фактора некрозу пухлини альфа. Таким чином, МНА, отриманий з ПММО, сприяє імунній регуляції Т-клітин та є потенційною мішенню імунотерапії для лікування раку людини.
Метаболіти, що походять від пухлини, можуть мати глибокий гальмівний вплив на протипухлинний імунітет, і все більше доказів свідчать про те, що вони також можуть служити ключовою рушійною силою прогресування захворювання (1). Окрім ефекту Варбурга, нещодавні дослідження почали характеризувати метаболічний стан пухлинних клітин та його зв'язок з імунним станом пухлинного мікрооточення (TME). Дослідження на моделях мишей та людських Т-клітинах показали, що метаболізм глутаміну (2), окислювальний метаболізм (3) та метаболізм глюкози (4) можуть діяти незалежно на різні підгрупи імунних клітин. Кілька метаболітів у цих шляхах пригнічують протипухлинну функцію Т-клітин. Було доведено, що блокада коферменту тетрагідробіоптерину (BH4) може пошкодити проліферацію Т-клітин, а збільшення BH4 в організмі може посилити протипухлинну імунну відповідь, опосередковану CD4 та CD8. Крім того, імуносупресивний ефект кінуреніну можна відновити шляхом введення BH4 (5). У гліобластомі з мутацією ізоцитратдегідрогенази (IDH) секреція енантіометаболічного (R)-2-гідроксиглутарату (R-2-HG) пригнічує активацію, проліферацію та цитоліз Т-клітин (6). Нещодавно було показано, що метилгліоксаль, побічний продукт гліколізу, виробляється супресорними клітинами мієлоїдного походження, і перенесення метилгліоксалю Т-клітинами може пригнічувати функцію ефекторних Т-клітин. Під час лікування нейтралізація метилгліоксалю може подолати активність супресорних клітин мієлоїдного походження (MDSC) та синергічно посилити терапію блокади контрольних точок у мишачих моделях (7). Ці дослідження разом підкреслюють ключову роль метаболітів, отриманих з TME, у регуляції функції та активності Т-клітин.
Дисфункція Т-клітин широко повідомлялася при раку яєчників (8). Частково це пов'язано з метаболічними характеристиками, властивими гіпоксії та аномальною васкулатурою пухлини (9), що призводить до перетворення глюкози та триптофану на побічні продукти, такі як молочна кислота та кінуренін. Надмірний позаклітинний лактат знижує вироблення інтерферону-γ (IFN-γ) та стимулює диференціацію мієлосупресивних підгруп (10, 11). Споживання триптофану безпосередньо пригнічує проліферацію Т-клітин та пригнічує сигналізацію Т-клітинних рецепторів (12-14). Незважаючи на ці спостереження, багато робіт, пов'язаних з імунним метаболізмом, було проведено в культурі Т-клітин in vitro з використанням оптимізованих середовищ або обмежено гомологічними моделями мишей in vivo, жодна з яких не повністю відображає гетерогенність раку людини та фізіологічного макро- та мікросередовища.
Спільною рисою раку яєчників є поширення по очеревині та поява асциту. Накопичення клітинної рідини в асциті пов'язане з запущеним захворюванням та поганим прогнозом (15). Згідно з повідомленнями, цей унікальний компартмент є гіпоксичним, має високий рівень фактора росту судинного ендотелію (VEGF) та індоламін-2,3-діоксигенази (IDO), а також інфільтрований Т-регуляторними клітинами та мієлоїдними інгібіторними клітинами (15-18). Метаболічне середовище асциту може відрізнятися від середовища самої пухлини, тому перепрограмування Т-клітин у очеревині залишається незрозумілим. Крім того, ключові відмінності та гетерогенність між асцитом та метаболітами, присутніми в середовищі пухлини, можуть перешкоджати інфільтрації імунних клітин та їх функціонуванню на пухлинах, тому необхідні подальші дослідження.
Щоб вирішити ці проблеми, ми розробили чутливий метод розділення клітин та рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS) для вивчення різних типів клітин (включаючи CD4+ та CD8+ Т-клітини), а також всередині та між пухлинами. Його метаболіти охоплюють клітини в тому ж асциті та пухлинному середовищі пацієнта. Ми використовуємо цей метод у поєднанні з високовимірною проточною цитометрією та секвенуванням РНК окремих клітин (scRNA-seq), щоб отримати високороздільну картину метаболічного стану цих ключових популяцій. Цей метод виявив значне підвищення рівня 1-метилнікотинаміду (MNA) в пухлинних Т-клітинах, а експерименти in vitro показали, що імуномодулюючий вплив MNA на функцію Т-клітин раніше був невідомим. Загалом, цей метод виявляє взаємну метаболічну взаємодію між пухлинами та імунними клітинами та надає унікальне розуміння метаболітів імунної регуляції, що може бути корисним для лікування раку яєчників за допомогою імунотерапії на основі Т-клітин. Можливості лікування.
Ми використовували високовимірну проточну цитометрію для одночасної кількісної оцінки поглинання глюкози [2-(N-(7-нітрофеніл-2-окса-1,3-діаза-4-іл)аміно)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) та мітохондріальна активність [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) – це типові маркери, що супроводжують імунні клітини та популяції пухлинних клітин (Таблиця S2 та Рисунок S1A). Цей аналіз показав, що порівняно з Т-клітинами, асцитичні та пухлинні клітини мають вищі рівні поглинання глюкози, але менші відмінності в мітохондріальній активності. Середнє поглинання глюкози пухлинними клітинами [CD45-EpCAM (EpCAM)+] у три-чотири рази перевищує показник Т-клітин, а середнє поглинання глюкози CD4+ Т-клітин у 1,2 раза перевищує показник CD8+ Т-клітин, що вказує на різні метаболічні потреби пухлинно-інфільтруючих лімфоцитів (TIL) навіть в одному й тому ж пухлинному середовищі (Рисунок 1A). На противагу цьому, мітохондріальна активність у пухлинних клітинах подібна до активності CD4+ Т-клітин, а мітохондріальна активність обох типів клітин вища, ніж у CD8+ Т-клітин (Рисунок 1B). Загалом, ці результати показують рівень метаболізму. Метаболічна активність пухлинних клітин вища, ніж у CD4+ Т-клітин, а метаболічна активність CD4+ Т-клітин вища, ніж у CD8+ Т-клітин. Незважаючи на ці ефекти між типами клітин, немає послідовної різниці в метаболічному стані CD4+ та CD8+ Т-клітин або їх відносних пропорціях в асциті порівняно з пухлинами (Рисунок 1C). На противагу цьому, у фракції CD45-клітин частка клітин EpCAM+ у пухлині збільшилася порівняно з асцитом (Рисунок 1D). Ми також спостерігали чітку метаболічну різницю між компонентами EpCAM+ та EpCAM- клітин. Клітини EpCAM+ (пухлина) мають вище поглинання глюкози та мітохондріальну активність, ніж клітини EpCAM-, що значно вище, ніж метаболічна активність фібробластів у пухлинних клітинах при тромбоемболії міокарда (Рисунок 1, E та F).
(A та B) Медіанна інтенсивність флуоресценції (MFI) поглинання глюкози (2-NBDG) (A) та мітохондріальна активність CD4+ T-клітин (темно-червоний MitoTracker) (B) Репрезентативні графіки (ліворуч) та табличні дані (праворуч), CD8+ T-клітини та EpCAM+ CD45-пухлинні клітини з асциту та пухлини. (C) Співвідношення CD4+ та CD8+ клітин (CD3+ T-клітин) в асциті та пухлині. (D) Частка EpCAM+ пухлинних клітин в асциті та пухлині (CD45−). (E та F) Поглинання глюкози EpCAM+ CD45-пухлиною та EpCAM-CD45-матриксом (2-NBDG) (E) та мітохондріальна активність (темно-червоний MitoTracker) (F) репрезентативні графіки (ліворуч) та табличні дані (праворуч) Асцит та пухлинні клітини. (G) Репрезентативні графіки експресії CD25, CD137 та PD1 за допомогою проточної цитометрії. (H та I) Експресія CD25, CD137 та PD1 на CD4+ T-клітинах (H) та CD8+ T-клітинах (I). (J та K) Наївні фенотипи центральної пам'яті (Tcm), ефекторні (Teff) та ефекторні (Tem) на основі експресії CCR7 та CD45RO. Репрезентативні зображення (ліворуч) та табличні дані (праворуч) CD4+ T-клітин (J) та CD8+ T-клітин (K) в асциті та пухлинах. Значення P визначаються парним t-тестом (*P<0,05, **P<0,01 та ***P<0,001). Лінія представляє зіставлених пацієнтів (n = 6). FMO, флуоресценція мінус один; MFI, медіанна інтенсивність флуоресценції.
Подальший аналіз виявив інші суттєві відмінності між фенотипічним статусом високорозділених Т-клітин. Активована (Рис. 1, G-I) та ефекторна пам'ять (Рис. 1, J та K) у пухлинах зустрічаються набагато частіше, ніж асцит (частка CD3+ Т-клітин). Аналогічно, аналіз фенотипу за експресією маркерів активації (CD25 та CD137) та маркерів виснаження [білок програмованої клітинної смерті 1 (PD1)] показав, що хоча метаболічні характеристики цих популяцій різні (Рис. S1, B-E), суттєвих метаболічних відмінностей між наївними, ефекторними або пам'яттєвими підмножинами не спостерігалося (Рис. S1, F-I). Ці результати були підтверджені за допомогою методів машинного навчання для автоматичного призначення фенотипів клітин (21), що додатково виявило наявність великої кількості клітин кісткового мозку (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) в асциті пацієнта (Рис. S2A). Серед усіх ідентифікованих типів клітин ця популяція мієлоїдних клітин показала найвище поглинання глюкози та мітохондріальну активність (Рис. S2, B-G). Ці результати підкреслюють сильні метаболічні відмінності між різними типами клітин, виявленими в асциті та пухлинах у пацієнтів з ГГСК.
Головною проблемою в розумінні метабономічних характеристик TIL є необхідність виділення зразків Т-клітин достатньої чистоти, якості та кількості з пухлин. Нещодавні дослідження показали, що методи сортування та збагачення кульками, засновані на проточній цитометрії, можуть призвести до змін у профілях клітинних метаболітів (22-24). Щоб подолати цю проблему, ми оптимізували метод збагачення кульками для виділення та ізоляції TIL з хірургічно резецованого раку яєчників людини перед аналізом за допомогою LC-MS/MS (див. Матеріали та методи; Рисунок 2A). Щоб оцінити загальний вплив цього протоколу на зміни метаболітів, ми порівняли профілі метаболітів Т-клітин, активованих здоровими донорами після вищезгаданого етапу розділення кульок, з клітинами, які не були розділені кульками, а залишалися на льоду. Цей аналіз контролю якості виявив, що існує висока кореляція між цими двома умовами (r = 0,77), а технічна повторюваність групи з 86 метаболітів має високу повторюваність (Рисунок 2B). Таким чином, ці методи можуть виконувати точний аналіз метаболітів у клітинах, що проходять збагачення клітинного типу, забезпечуючи тим самим першу платформу високої роздільної здатності для ідентифікації специфічних метаболітів у ГССК, що дозволяє людям глибше зрозуміти специфічність клітинної програми статевого метаболізму.
(A) Схематична діаграма збагачення магнітними кульками. Перед аналізом за допомогою LC-MS/MS клітини проходять три послідовні раунди збагачення магнітними кульками або залишаються на льоду. (B) Вплив типу збагачення на кількість метаболітів. Середнє значення трьох вимірювань для кожного типу збагачення ± стандартна помилка (SE). Сіра лінія представляє співвідношення 1:1. Внутрішньокласова кореляція (ICC) повторних вимірювань показана на осі. NAD, нікотинамідаденіндинуклеотид. (C) Схематична діаграма робочого процесу аналізу метаболітів пацієнта. Асцит або пухлини збирають у пацієнтів та кріоконсервують. Невелику частину кожного зразка аналізують за допомогою проточної цитометрії, тоді як решта зразків проходять три раунди збагачення для клітин CD4+, CD8+ та CD45-. Ці фракції клітин аналізують за допомогою LC-MS/MS. (D) Теплова карта стандартизованої кількості метаболітів. Дендрограма представляє кластеризацію Вардом евклідових відстаней між зразками. (E) Аналіз головних компонент (ГКМ) карти метаболітів зразка, що показує три повторності кожного зразка, зразки від одного пацієнта з'єднані лінією. (F) ГКМ профілю метаболітів зразка, обумовленого пацієнтом (тобто з використанням часткової надмірності); тип зразка обмежений опуклою оболонкою. PC1, основний компонент 1; PC2, основний компонент 2.
Далі ми застосували цей метод збагачення для аналізу 99 метаболітів у фракціях CD4+, CD8+ та CD45-клітин у первинному асциті та пухлинах шести пацієнтів з HGSC (Рисунок 2C, Рисунок S3A та Таблиця S3 та S4). Популяція, що нас цікавить, становить від 2% до 70% від початкової великої вибірки живих клітин, і частка клітин значно варіюється між пацієнтами. Після відділення кульок збагачена фракція, що нас цікавить (CD4+, CD8+ або CD45-), становить в середньому понад 85% усіх живих клітин у зразку. Цей метод збагачення дозволяє нам аналізувати популяції клітин з метаболізму тканин пухлини людини, що неможливо зробити з великих зразків. Використовуючи цей протокол, ми визначили, що l-кінуренін та аденозин, ці два добре охарактеризовані імуносупресивні метаболіти, були підвищені в пухлинних Т-клітинах або пухлинних клітинах (Рисунок S3, B та C). Таким чином, ці результати демонструють точність та здатність нашої технології розділення клітин та мас-спектрометрії знаходити біологічно важливі метаболіти в тканинах пацієнтів.
Наш аналіз також виявив сильну метаболічну розділеність типів клітин у пацієнтів та між ними (Рисунок 2D та Рисунок S4A). Зокрема, порівняно з іншими пацієнтами, пацієнт 70 демонстрував різні метаболічні характеристики (Рисунок 2E та Рисунок S4B), що вказує на можливу суттєву метаболічну гетерогенність між пацієнтами. Варто зазначити, що порівняно з іншими пацієнтами (від 1,2 до 2 літрів; Таблиця S1), загальна кількість асциту, зібраного у пацієнта 70 (80 мл), була меншою. Контроль міжпацієнтної гетерогенності під час аналізу головних компонентів (наприклад, за допомогою аналізу часткової надмірності) показує послідовні зміни між типами клітин, а типи клітин та/або мікрооточення чітко агреговані відповідно до профілю метаболітів (Рисунок 2F). Аналіз окремих метаболітів підкреслив ці ефекти та виявив значні відмінності між типами клітин та мікрооточенням. Варто зазначити, що найбільш екстремальною спостережуваною відмінністю є MNA, яка зазвичай збагачена CD45-клітинами та CD4+ та CD8+ клітинами, що інфільтрують пухлину (Рисунок 3A). Для CD4+ клітин цей ефект найбільш очевидний, і MNA в CD8+ клітинах також, здається, сильно залежить від навколишнього середовища. Однак це не є важливим, оскільки лише у трьох із шести пацієнтів можна оцінити показники CD8+ пухлини. Окрім MNA, у різних типах клітин асциту та пухлин інші метаболіти, які погано охарактеризовані при TIL, також є різно багатими (рисунки S3 та S4). Таким чином, ці дані свідчать про перспективний набір імуномодулюючих метаболітів для подальших досліджень.
(A) Нормалізований вміст MNA в клітинах CD4+, CD8+ та CD45- з асциту та пухлини. Коробчаста діаграма показує медіану (лінія), міжквартильний діапазон (шарнір рамки) та діапазон даних, до 1,5-кратного міжквартильного діапазону (вусик рамки). Як описано в розділі «Матеріали та методи для пацієнтів», використовуйте значення лімми пацієнта для визначення значення P (*P<0,05 та **P<0,01). (B) Схематична діаграма метаболізму MNA (60). Метаболіти: S-аденозил-1-метіонін; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеїн; NA, нікотинамід; MNA, 1-метилнікотинамід; 2-PY, 1-метил-2-піридон-5-карбоксамід; 4-PY, 1-метил-4-піридон-5-карбоксамід; NR, нікотинамід-рибоза; NMN, нікотинамід-мононуклеотид. Ферменти (зелений): NNMT, нікотинамід-N-метилтрансфераза; SIRT, сіртуїни; NAMPT, нікотинамідфосфорибозилтрансфераза; AOX1, альдегідоксидаза 1; NRK, нікотинамідрибозидкіназа; NMNAT, нікотинамідмононуклеотид-аденілаттрансфераза; Pnp1, пурин-нуклеозидфосфорилаза. (C) t-SNE scRNA-seq асциту (сірий) та пухлини (червоний; n = 3 пацієнти). (D) Експресія NNMT у різних популяціях клітин, ідентифікованих за допомогою scRNA-seq. (E) Експресія NNMT та AOX1 у SK-OV-3, ембріональній нирці людини (HEK) 293T, Т-клітинах та Т-клітинах, оброблених MNA. Показано складчасту експресію відносно SK-OV-3. Показано картину експресії за допомогою SEM (n = 6 здорових донорів). Значення Ct більше 35 вважаються невиявними (UD). (F) Експресія SLC22A1 та SLC22A2 у SK-OV-3, HEK293T, Т-клітинах та Т-клітинах, оброблених 8 мМ MNA. Показано складену експресію відносно SK-OV-3. Показано картину експресії за допомогою SEM (n = 6 здорових донорів). Значення Ct більше 35 вважаються невиявними (UD). (G) Вміст MNA клітин в активованих здорових Т-клітинах донорів після 72 годин інкубації з MNA. Показано картину експресії за допомогою SEM (n = 4 здорових донори).
МНА утворюється шляхом перенесення метильної групи з S-аденозил-1-метіоніну (SAM) на нікотинамід (NA) за допомогою нікотинамід-N-метилтрансферази (NNMT; Рисунок 3B). NNMT надмірно експресується в різних видах раку людини та пов'язаний з проліферацією, інвазією та метастазуванням (25-27). Щоб краще зрозуміти джерело MNA в Т-клітинах при TME, ми використовували scRNA-seq для характеристики експресії NNMT в різних типах клітин в асциті та пухлинах трьох пацієнтів з HGSC (Таблиця S5). Аналіз приблизно 6500 клітин показав, що в асциті та пухлинному середовищі експресія NNMT була обмежена передбачуваними популяціями фібробластів та пухлинних клітин (Рисунок 3, C та D). Варто зазначити, що немає очевидної експресії NNMT в жодній популяції, яка експресує PTPRC (CD45+) (Рисунок 3D та Рисунок S5A), що вказує на те, що MNA, виявлена ​​в спектрі метаболітів, була введена в Т-клітини. Експресія альдегідоксидази 1 (AOX1) перетворює MNA на 1-метил-2-піридон-5-карбоксамід (2-PYR) або 1-метил-4-піридон-5-карбоксамід (4-PYR); Рисунок 3B) також обмежена популяцією фібробластів, що експресують COL1A1 (Рисунок S5A), що разом вказує на те, що Т-клітини не мають здатності до звичайного метаболізму MNA. Характер експресії цих генів, пов'язаних з MNA, був перевірений за допомогою другого незалежного набору клітинних даних з асциту пацієнтів з HGSC (Рисунок S5B; n = 6) (16). Крім того, кількісний аналіз полімеразної ланцюгової реакції (qPCR) здорових донорських Т-клітин, оброблених MNA, показав, що порівняно з контрольними клітинами пухлини яєчників SK-OV-3, NNMT або AOX1 майже не експресувалися (Рисунок 3E). Ці неочікувані результати вказують на те, що MNA може секретуватися з фібробластів або пухлин у сусідні Т-клітини при TME.
Хоча кандидатами є родина органічних катіонних транспортерів 1-3 (OCT1, OCT2 та OCT3), що кодуються родиною розчинних переносників 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 та SLC22A3), потенційні транспортери MNA досі не визначені (28). КПЛР мРНК зі здорових донорських Т-клітин показала низькі рівні експресії SLC22A1, але невизначені рівні SLC22A2, що підтверджує, що про це повідомлялося раніше в літературі (Рисунок 3F) (29). На противагу цьому, лінія пухлинних клітин яєчників SK-OV-3 експресувала високі рівні обох транспортерів (Рисунок 3F).
Щоб перевірити можливість здатності Т-клітин поглинати чужорідну MNA, здорові донорські Т-клітини культивували протягом 72 годин у присутності різних концентрацій MNA. За відсутності екзогенної MNA клітинний вміст MNA неможливо виявити (Рисунок 3G). Однак активовані Т-клітини, оброблені екзогенною MNA, показали дозозалежне збільшення вмісту MNA в клітинах, до 6 мМ MNA (Рисунок 3G). Цей результат вказує на те, що, незважаючи на низький рівень експресії транспортера та відсутність основного ферменту, відповідального за внутрішньоклітинний метаболізм MNA, TIL все ще може поглинати MNA.
Спектр метаболітів у Т-клітинах пацієнтів та експерименти з поглинанням MNA in vitro збільшують ймовірність того, що фібробласти, асоційовані з раком (CAF), секретують MNA, і пухлинні клітини можуть регулювати фенотип і функцію TIL. Щоб визначити вплив MNA на Т-клітини, здорові донорські Т-клітини були активовані in vitro у присутності або відсутності MNA, і була оцінена їхня проліферація та продукція цитокінів. Після 7 днів додавання MNA у найвищій дозі кількість подвоєння популяції помірно зменшилася, тоді як енергія зберігалася при всіх дозах (Рисунок 4A). Крім того, лікування екзогенним MNA призвело до збільшення частки CD4+ та CD8+ Т-клітин, що експресують фактор некрозу пухлини-α (TNFα; Рисунок 4B). Навпаки, внутрішньоклітинна продукція IFN-γ була значно знижена в CD4+ Т-клітинах, але не в CD8+ Т-клітинах, і не було суттєвих змін інтерлейкіну 2 (IL-2; Рисунок 4, C та D). Отже, імуноферментний аналіз (ІФА) супернатантів цих культур Т-клітин, оброблених MNA, показав значне збільшення TNFα, зниження IFN-γ та відсутність змін IL-2 (Рисунок 4, E-G). Зниження IFN-γ вказує на те, що MNA може відігравати певну роль в пригніченні протипухлинної активності Т-клітин. Для імітації впливу MNA на цитотоксичність, опосередковану Т-клітинами, здорові мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) донорів продукують химерні клітини антигенного рецептора Т (FRα-CAR-T), що націлені на рецептор фолату α та клітини CAR-T (GFP), регульовані зеленим флуоресцентним білком (GFP)-CAR-T. CAR-T-клітини культивували протягом 24 годин у присутності MNA, а потім спільно культивували з людськими клітинами пухлини яєчників SK-OV-3, що експресують рецептор фолату α, у співвідношенні ефектора до мішені 10:1. Обробка MNA призвела до значного зниження активності знищення клітин FRα-CAR-T, що було подібним до клітин FRα-CAR-T, оброблених аденозином (Рисунок 4H).
(A) Загальна кількість життєздатних клітин та подвоєння популяції (PD) безпосередньо з культури на 7-й день. Гістограма представляє середнє значення + SEM шести здорових донорів. Представляє дані щонайменше з n = 3 незалежних експериментів. (B - D) CD3/CD28 та IL-2 використовували для активації Т-клітин у відповідних концентраціях MNA протягом 7 днів. Перед аналізом клітини стимулювали PMA/іономіцином з GolgiStop протягом 4 годин. Експресія TNFα (B) у Т-клітинах. Приклад зображення (ліворуч) та табличні дані (праворуч) експресії TNFα у живих клітинах. Експресія IFN-γ (C) та IL-2 (D) у Т-клітинах. Експресію цитокінів вимірювали за допомогою проточної цитометрії. Гістограма представляє середнє значення (n = 6 здорових донорів) + SEM. Використовуйте однофакторний дисперсійний аналіз та повторні вимірювання (*P<0,05 та **P<0,01) для визначення значення P. Представляє дані щонайменше з n = 3 незалежних експериментів. (E-G) CD3/CD28 та IL-2 використовували для активації Т-клітин при відповідних концентраціях MNA протягом 7 днів. Середовище збирали до та після 4 годин стимуляції PMA/іономіцином. Концентрації TNFα (E), IFN-γ (F) та IL-2 (G) вимірювали за допомогою ELISA. Гістограма представляє середнє значення (n = 5 здорових донорів) + SEM. Значення P визначали за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу та повторних вимірювань (*P<0,05). Пунктирна лінія вказує на межу виявлення. (H) Аналіз лізису клітин. Клітини FRα-CAR-T або GFP-CAR-T обробляли аденозином (250 мкМ) або MNA (10 мМ) протягом 24 годин або залишали необробленими (Ctrl). Вимірювали відсоток знищення клітин SK-OV-3. Значення P визначали за допомогою t-тесту Велча (*P<0,5 та **P<0,01).
Для того, щоб отримати механістичне розуміння регуляції експресії TNFα, залежної від MNA, були оцінені зміни в мРНК TNFα Т-клітин, оброблених MNA (Рисунок 5A). Здорові донорські Т-клітини, оброблені MNA, показали дворазове збільшення рівнів транскрипції TNFα, що вказує на залежність MNA від регуляції транскрипції TNFα. Щоб дослідити цей можливий регуляторний механізм, два відомі транскрипційні фактори, що регулюють TNFα, а саме активований ядерний фактор Т-клітин (NFAT) та специфічний білок 1 (Sp1), були оцінені у відповідь на зв'язування MNA з проксимальним промотором TNFα (30). Промотор TNFα містить 6 ідентифікованих сайтів зв'язування NFAT та 2 сайти зв'язування Sp1, що перекриваються в одному сайті [-55 пар основ (п.о.) від 5'-кепа] (30). Імунопреципітація хроматину (ChIP) показала, що при обробці MNA зв'язування Sp1 з промотором TNFα збільшилося втричі. Включення NFAT також збільшилося і набуло важливості (Рисунок 5B). Ці дані вказують на те, що MNA регулює експресію TNFα через транскрипцію Sp1, і меншою мірою експресію NFAT.
(A) Порівняно з Т-клітинами, культивованими без MNA, кратність зміни експресії TNFα у Т-клітинах, оброблених MNA. Показано картину експресії за допомогою SEM (n = 5 здорових донорів). Представляє дані щонайменше з n = 3 незалежних експериментів. (B) Промотор TNFα Т-клітин, оброблених з 8 мМ MNA або без нього після поєднання NFAT та Sp1 зі стимуляцією (Ctrl) та PMA/іономіцином протягом 4 годин. Імуноглобулін G (IgG) та H3 використовувалися як негативний та позитивний контролі для імунопреципітації відповідно. Кількісне визначення ChIP показало, що зв'язування Sp1 та NFAT з промотором TNFα у клітинах, оброблених MNA, збільшилося в кілька разів порівняно з контролем. Представляє дані щонайменше з n = 3 незалежних експериментів. Значення P визначено за допомогою кількох t-тестів (*** P <0,01). (C) Порівняно з асцитом HGSC, Т-клітини (нецитотоксичні) показали підвищену експресію TNF у пухлині. Кольори представляють різних пацієнтів. Відображені клітини були випадковим чином вибірково відібрані до 300 та змішані, щоб обмежити перевантаження (** Padj = 0,0076). (D) Запропонована модель MNA для раку яєчників. MNA продукується в пухлинних клітинах та фібробластах у TME та поглинається Т-клітинами. MNA збільшує зв'язування Sp1 з промотором TNFα, що призводить до збільшення транскрипції TNFα та продукування цитокінів TNFα. MNA також викликає зниження IFN-γ. Пригнічення функції Т-клітин призводить до зниження здатності до знищення та прискорення росту пухлини.
Згідно з повідомленнями, TNFα має фронтально- та зворотно-залежні протипухлинні та протипухлинні ефекти, але він має добре відому роль у сприянні росту та метастазуванню раку яєчників (31-33). Згідно з повідомленнями, концентрація TNFα в асциті та пухлинних тканинах у пацієнтів з раком яєчників вища, ніж у доброякісних тканинах (34-36). З точки зору механізму, TNFα може регулювати активацію, функцію та проліферацію лейкоцитів, а також змінювати фенотип ракових клітин (37, 38). Відповідно до цих висновків, диференціальний аналіз експресії генів показав, що TNF значно підвищено регулюється в Т-клітинах пухлинних тканин порівняно з асцитом (Рисунок 5C). Збільшення експресії TNF було помітно лише в популяціях Т-клітин з нецитотоксичним фенотипом (Рисунок S5A). Таким чином, ці дані підтверджують думку, що MNA має подвійний імуносупресивний та пухлино-стимулюючий ефект при раку яєчників яєчників.
Флуоресцентне мічення на основі проточної цитометрії стало основним методом вивчення метаболізму TIL. Ці дослідження показали, що порівняно з лімфоцитами периферичної крові або Т-клітинами з вторинних лімфоїдних органів, мишачі та людські TIL мають вищу схильність до поглинання глюкози (4, 39) та поступову втрату мітохондріальної функції (19, 40). Хоча в цьому дослідженні ми спостерігали подібні результати, ключовим розвитком є ​​порівняння метаболізму пухлинних клітин та TIL з тієї ж резецированної пухлинної тканини. Відповідно до деяких з цих попередніх повідомлень, пухлинні (CD45-EpCAM+) клітини з асциту та пухлин мають вище поглинання глюкози, ніж CD8+ та CD4+ Т-клітини, що підтверджує, що високе поглинання глюкози пухлинними клітинами можна порівняти з Т-клітинами. Концепція конкуренції Т-клітин. TME. Однак мітохондріальна активність пухлинних клітин вища, ніж у CD8+ Т-клітин, але мітохондріальна активність подібна до активності CD4+ Т-клітин. Ці результати підтверджують нову тему про те, що окислювальний метаболізм важливий для пухлинних клітин (41, 42). Вони також припускають, що CD8+ Т-клітини можуть бути більш схильними до оксидативної дисфункції, ніж CD4+ Т-клітини, або що CD4+ Т-клітини можуть використовувати джерела вуглецю, крім глюкози, для підтримки мітохондріальної активності (43, 44). Слід зазначити, що ми не спостерігали жодної різниці в поглинанні глюкози або мітохондріальній активності між CD4+ Т-ефекторами, Т-ефекторними клітинами пам'яті та Т-центральними клітинами пам'яті в асциті. Аналогічно, стан диференціації CD8+ Т-клітин у пухлинах не має нічого спільного зі змінами в поглинанні глюкози, що підкреслює значну різницю між Т-клітинами, культивованими in vitro, та людською TIL in vivo (22). Ці спостереження також були підтверджені використанням неупередженого автоматичного розподілу популяції клітин, який додатково показав, що CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ клітини з вищим поглинанням глюкози та мітохондріальною активністю, ніж пухлинні клітини, є поширеними, але мають метаболічно активну популяцію клітин. Ця популяція може представляти собою передбачувану субпопуляцію мієлоїдних клітин-супресорів або плазмоцитоїдних дендритних клітин, ідентифікованих в аналізі scRNA-seq. Хоча обидва ці прояви були зареєстровані в пухлинах яєчників людини [45], вони все ще потребують подальшої роботи, щоб описати цю мієлоїдну субпопуляцію.
Хоча методи на основі проточної цитометрії можуть прояснити загальні відмінності в метаболізмі глюкози та окислювальному метаболізмі між типами клітин, точні метаболіти, що утворюються глюкозою або іншими джерелами вуглецю для мітохондріального метаболізму в TME, ще не визначені. Віднесення наявності або відсутності метаболітів до певної підмножини TIL вимагає очищення популяції клітин з видаленої тканини. Тому наш метод збагачення клітин у поєднанні з мас-спектрометрією може дати уявлення про метаболіти, які диференційно збагачені в Т-клітинах та популяціях пухлинних клітин у відповідних зразках пацієнтів. Хоча цей метод має переваги перед сортуванням клітин, активованим флуоресценцією, певні бібліотеки метаболітів можуть бути уражені через притаманну стабільність та/або швидку швидкість оновлення (22). Тим не менш, наш метод дозволив ідентифікувати два визнаних імуносупресивних метаболіти, аденозин та кінуренін, оскільки вони значно відрізняються між типами зразків.
Наш метабономічний аналіз пухлин та підтипів TIL дає більше інформації про роль метаболітів у метаболізмі мітохондрій яєчників (TME). По-перше, за допомогою проточної цитометрії ми визначили, що немає різниці в мітохондріальній активності між пухлинами та CD4+ T-клітинами. Однак аналіз LC-MS/MS виявив значні зміни в кількості метаболітів серед цих популяцій, що вказує на те, що висновки щодо метаболізму TIL та його загальної метаболічної активності потребують ретельної інтерпретації. По-друге, MNA є метаболітом з найбільшою різницею між CD45-клітинами та T-клітинами в асциті, а не в пухлинах. Отже, компартменталізація та розташування пухлини можуть мати різний вплив на метаболізм TIL, що підкреслює можливу гетерогенність у даному мікросередовищі. По-третє, експресія ферменту NNMT, що продукує MNA, в основному обмежується CAF, який меншою мірою присутній у пухлинних клітинах, але виявляються рівні MNA в T-клітинах, що походять з пухлин. Надмірна експресія NNMT у CAF яєчників має відомий ефект, що сприяє розвитку раку, частково через сприяння метаболізму CAF, інвазію пухлини та метастазування (27). Хоча загальний рівень TIL є помірним, експресія NNMT у CAF тісно пов'язана з мезенхімальним підтипом Атласу геному раку (TCGA), який пов'язаний з поганим прогнозом (27, 46, 47). Нарешті, експресія ферменту AOX1, відповідального за деградацію MNA, також обмежена популяцією CAF, що вказує на відсутність здатності Т-клітин метаболізувати MNA. Ці результати підтверджують ідею про те, що, хоча для підтвердження цього висновку потрібні подальші дослідження, високий рівень MNA у Т-клітинах може свідчити про наявність імуносупресивного мікрооточення CAF.
Враховуючи низький рівень експресії транспортерів MNA та невизначені рівні ключових білків, що беруть участь у метаболізмі MNA, присутність MNA в Т-клітинах є неочікуваною. Ні NNMT, ні AOX1 не вдалося виявити за допомогою аналізу scRNA-seq та цільової кПЛР двох незалежних когорт. Ці результати вказують на те, що MNA не синтезується Т-клітинами, а абсорбується з навколишнього TME. Експерименти in vitro показують, що Т-клітини мають тенденцію накопичувати екзогенну MNA.
Наші дослідження in vitro показали, що екзогенний MNA індукує експресію TNFα у Т-клітинах та посилює зв'язування Sp1 з промотором TNFα. Хоча TNFα має як протипухлинні, так і протипухлинні функції, при раку яєчників TNFα може сприяти росту раку яєчників (31-33). Нейтралізація TNFα у культурі клітин пухлини яєчників або елімінація сигналу TNFα у мишачих моделях може покращити продукцію запальних цитокінів, опосередковану TNFα, та пригнічувати ріст пухлини (32, 35). Отже, у цьому випадку MNA, отримана з TME, може діяти як прозапальний метаболіт через TNFα-залежний механізм через аутокринну петлю, тим самим сприяючи виникненню та поширенню раку яєчників (31). Виходячи з цієї можливості, блокада TNFα вивчається як потенційний терапевтичний засіб для лікування раку яєчників (37, 48, 49). Крім того, MNA погіршує цитотоксичність CAR-T-клітин до клітин пухлини яєчників, що є додатковим доказом MNA-опосередкованого імуносупресивного ефекту. У сукупності ці результати свідчать про модель, в якій пухлини та клітини CAF секретують MNA у позаклітинний TME. Шляхом (i) стимуляції росту раку яєчників, індукованої TNF, та (ii) пригнічення цитотоксичної активності Т-клітин, індукованої MNA, це може мати подвійний пухлинний ефект (Рисунок 5D).
На завершення, застосовуючи комбінацію швидкого збагачення клітин, секвенування окремих клітин та метаболічного профілювання, це дослідження виявило величезні імунометаболомічні відмінності між пухлинними та асцитними клітинами у пацієнтів з раком великої рогатої худоби (HGSC). Цей комплексний аналіз показав, що існують відмінності в поглинанні глюкози та мітохондріальній активності між Т-клітинами, а також ідентифікував MNA як неклітинний автономний імунний регуляторний метаболіт. Ці дані впливають на те, як TME впливає на метаболізм Т-клітин у ракових захворюваннях людини. Хоча повідомлялося про пряму конкуренцію за поживні речовини між Т-клітинами та раковими клітинами, метаболіти також можуть діяти як непрямі регулятори, сприяючи прогресуванню пухлини та, можливо, пригнічуючи ендогенні імунні відповіді. Подальший опис функціональної ролі цих регуляторних метаболітів може відкрити альтернативні стратегії для посилення протипухлинної імунної відповіді.
Зразки пацієнтів та клінічні дані були отримані через репозиторій тканин раку молочної залози (РМЗ), сертифікований Канадською мережею репозиторіїв тканин. Відповідно до протоколу, затвердженого Комітетом з етики досліджень раку РМЗ та Університетом Британської Колумбії (H07-00463), всі зразки та клінічні дані пацієнтів отримали інформовану письмову згоду або офіційно відмовилися від своєї згоди. Зразки зберігаються в сертифікованому BioBank (BRC-00290). Детальні характеристики пацієнтів наведено в таблицях S1 та S5. Для кріоконсервації скальпель використовується для механічного розкладання зразка пухлини пацієнта, а потім проштовхується через 100-мікронний фільтр для отримання суспензії окремих клітин. Асцит пацієнта центрифугували при 1500 об/хв протягом 10 хвилин при 4°C для осаду клітин та видалення супернатанту. Клітини, отримані з пухлини та асциту, кріоконсервували в 50% інактивованій теплом людській сироватці крові AB (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) та 10% диметилсульфоксиді. Ці консервовані суспензії окремих клітин розморожували та використовували для метаболоміки та визначення метаболітів, описаних нижче.
Повне середовище складається з 0,22 мкм фільтрованого 50:50 середовища RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 мМ L-глутаміну (Thermo Fisher Scientific), доповненого 10% інактивованою нагріванням людською сироваткою AB (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ L-глутаміну (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific, 1 x розчин пеніциліну-стрептоміцину (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) та 50 мкМ меркаптоетанолу. AimV (Invitrogen) доповнений 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) та 2 мМ L-глутаміну (Thermo Fisher Scientific). Буфер для фарбування проточного цитометра складався з 0,22 мкм фільтрованого фосфатно-буферного фізіологічного розчину (PBS; Invitrogen), доповненого 3% інактивованою нагріванням людською сироваткою AB (Sigma). Буфер для збагачення клітин складається з 0,22 мкм фільтрованого PBS та доповненого 0,5% інактивованої нагріванням людської сироватки AB (Sigma-Aldrich).
У повному середовищі за температури 37°C клітини забарвлювали 10 нМ MT DR та 100 мкМ 2-NBDG протягом 30 хвилин. Далі клітини забарвлювали барвником життєздатності eF506 при 4°C протягом 15 хвилин. Ресуспендуйте клітини в буфері FC Block (eBioscience) та буфері Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), розведіть у буфері для забарвлення проточної цитометрії (відповідно до інструкцій виробника) та інкубуйте протягом 10 хвилин за кімнатної температури. Забарвлюйте клітини набором антитіл (Таблиця S2) у буфері для забарвлення проточної цитометрії при 4°C протягом 20 хвилин. Ресуспендуйте клітини у буфері для забарвлення проточної цитометрії (Cytek Aurora; конфігурація 3L-16V-14B-8R) перед аналізом. Використовуйте SpectroFlo та FlowJo V10 для аналізу даних кількості клітин та GraphPad Prism 8 для створення даних. Медіанну інтенсивність флуоресценції (MFI) 2-NBDG та MT DR було логарифмічно нормалізовано, а потім для статистичного аналізу було використано парний t-тест для врахування зіставлених пацієнтів. Видаліть з аналізу всі популяції з менш ніж 40 подіями; введіть значення MFI, рівне 1, для будь-яких негативних значень, перш ніж проводити статистичний аналіз та візуалізацію даних.
Щоб доповнити стратегію ручного стробування вищезгаданої панелі процесу, ми використали повну анотацію за допомогою дерева обмежень форми (FAUST) (21) для автоматичного призначення клітин популяції після видалення мертвих клітин у FlowJo. Ми вручну керуємо виходом, щоб об'єднати популяції, які, здається, розподілені неправильно (поєднання PD1+ з PD1-пухлинними клітинами), та збережені популяції. Кожен зразок містить в середньому понад 2% клітин, загалом 11 популяцій.
Для відділення PBMC від продуктів розділення лейкоцитів було використано центрифугування з градієнтом щільності фіколла (STEMCELL Technologies). CD8+ T-клітини були виділені з PBMC за допомогою CD8 MicroBeads (Miltenyi) та розмножені в повному середовищі за допомогою TransAct (Miltenyi) протягом 2 тижнів згідно з інструкціями виробника. Клітини залишали стояти 5 днів у повному середовищі, що містило IL-7 (10 нг/мл; PeproTech), а потім повторно стимулювали TransAct. На 7-й день, згідно з інструкціями виробника, для збагачення клітин у трьох послідовних раундах використовували людські CD45 MicroBeads (Miltenyi). Клітини розділяли на аліквоти для аналізу проточною цитометрією (як описано вище), а один мільйон клітин тричі розділяли на аліквоти для аналізу LC-MS/MS. Зразки обробляли за допомогою LC-MS/MS, як описано нижче. Ми оцінили значення відсутнього метаболіту з іонним числом 1000. Кожен зразок нормалізується за загальним числом іонів (TIC), логарифмічно перетворюється та автоматично нормалізується в MetaboAnalystR перед аналізом.
Суспензію окремих клітин кожного пацієнта розморожували та фільтрували через фільтр 40 мкм у повне середовище (як описано вище). Згідно з протоколом виробника, для збагачення зразків на клітини CD8+, CD4+ та CD45- (на льоду) було проведено три послідовні раунди позитивної селекції за допомогою магнітного розділення мікрокульок з використанням MicroBeads (Miltenyi). Коротше кажучи, клітини ресуспендували в буфері для збагачення клітин (як описано вище) та підраховували. Клітини інкубували з людськими мікрокульками CD8, людськими мікрокульками CD4 або людськими мікрокульками CD45 (Miltenyi) при 4°C протягом 15 хвилин, а потім промивали буфером для збагачення клітин. Зразок пропускали через колонку LS (Miltenyi), і збирали позитивні та негативні фракції. Щоб скоротити тривалість та максимізувати етап відновлення клітин, фракцію CD8 потім використовують для другого раунду збагачення CD4+, а фракцію CD4 - для наступного збагачення CD45. Тримайте розчин на льоду протягом усього процесу розділення.
Для підготовки зразків до аналізу метаболітів клітини один раз промивали крижаним розчином солі, до кожного зразка додавали 1 мл 80% метанолу, потім перемішували на вортексі та швидко заморожували у рідкому азоті. Зразки піддавали трьом циклам заморожування-розморожування та центрифугували при 14 000 об/хв протягом 15 хвилин при 4°C. Супернатант, що містив метаболіти, випаровували до висихання. Метаболіти повторно розчиняли у 50 мкл 0,03% мурашиної кислоти, перемішували на вортексі, а потім центрифугували для видалення залишків.
Екстрагуйте метаболіти, як описано вище. Перенесіть супернатант у флакон високоефективної рідинної хроматографії для метаболомічних досліджень. Використовуйте протокол випадкової обробки для обробки кожного зразка подібною кількістю клітин, щоб запобігти ефектам партії. Ми провели якісну оцінку глобальних метаболітів, опубліковану раніше, на триквадрупольному мас-спектрометрі AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Хроматографічний аналіз та інтегрування площі піків проводили за допомогою програмного забезпечення MultiQuant версії 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Для оцінки значення відсутнього метаболіту було використано кількість іонів 1000, а TIC кожного зразка – для розрахунку нормалізованої площі піку кожного виявленого метаболіту з метою корекції змін, внесених інструментальним аналізом під час обробки зразка. Після нормалізації TIC для логарифмічного перетворення та автоматичного масштабування лінії норми використовується MetaboAnalystR(51) (параметр за замовчуванням). Ми використовували PCA з пакетом vegan R для проведення дослідницького аналізу відмінностей метаболому між типами зразків та аналіз часткової надмірності для аналізу пацієнтів. Використовували метод Варда для побудови дендрограми теплової карти для кластеризації евклідової відстані між зразками. Ми використовували ліму (52) для стандартизованої кількості метаболітів, щоб ідентифікувати диференційно поширені метаболіти по всьому типу клітин та мікросередовищу. Для спрощення пояснення ми використовуємо параметр середнього значення групи для визначення моделі та розглядаємо типи клітин у мікросередовищі як кожну групу (n = 6 груп); для тесту на значущість ми виконали три повторні вимірювання для кожного метаболіту. Щоб уникнути хибної реплікації, пацієнт був включений як перешкода в дизайн ліми. Щоб перевірити відмінності в метаболітах між різними пацієнтами, ми скоригували модель лімми, включаючи пацієнтів фіксованим чином. Ми повідомляємо про значущість заздалегідь заданого контрасту між типом клітин та мікрооточенням Padj <0,05 (корекція Бенджаміні-Хохберга).
Після збагачення енергією клітин за допомогою набору для видалення мертвих клітин Miltenyi (життєздатність >80%), було проведено секвенування транскриптомів окремих клітин на загальних живих заморожених зразках асциту та пухлини з використанням протоколу експресії генів 10x 5′. Було проаналізовано п'ять випадків зі відповідними пухлинами та асцитом, хоча низька життєздатність одного зразка пухлини перешкоджала його включенню. Щоб досягти множинного відбору пацієнтів, ми об'єднали зразки кожного пацієнта в доріжках 10x chromium controller та окремо проаналізували асцит та ділянки пухлини. Після секвенування [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; в середньому 73 488 та 41 378 зчитувань на клітину для пухлини та асциту відповідно]], ми використовували CellSNP та Vireo (53) (на основі CellSNP як Загальний людський SNP (VCF), що надається GRCh38, присвоюється донорській ідентичності. Ми використовуємо SNPRelate для визначення найближчої ідентичності (IBS) генотипового статусу пацієнта (IBS), виключаючи непризначені клітини та клітини, ідентифіковані як дуплекси, та відповідні донори між зразками асциту та пухлини (54). На основі цього завдання ми зберегли три випадки з рясним представництвом клітин у пухлині та асциті для подальшого аналізу. Після виконання етапу масової фільтрації в упаковці BioConductor scater (55) та scran (56) було отримано 6975 клітин (2792 та 4183 клітини з пухлини та асциту відповідно) для аналізу. Ми використовуємо кластеризацію Лувена (SNN) спільної мережі найближчих сусідів (SNN) igraph (57) на основі відстані Жаккара до кластерних клітин за експресією. Кластери були вручну анотовані до передбачуваних типів клітин на основі експресії маркерних генів та візуалізовані за допомогою t-SNE. Цитотоксичні Т-клітини визначаються експресією CD8A та GZMA, за винятком субкластерів з низькою експресією рибосомного білка. Ми отримали доступ до опублікованих даних Ізара та ін. (16), включаючи їх вбудовування t-SNE, яке може контролювати перекриття експресії між маркерами імунних клітин та експресією NNMT.
PBMC були відокремлені від продуктів розділення лейкоцитів (STEMCELL Technologies) за допомогою градієнтного центрифугування Ficoll у градієнті щільності. CD3+ клітини були виділені з PBMC за допомогою CD3-кульок (Miltenyi). У присутності або відсутності MNA, CD3+ клітини були активовані зв'язаним з пластиною CD3 (5 мкг/мл), розчинним CD28 (3 мкг/мл) та IL-2 (300 Од/мл; Proleukin). В останній день експансії життєздатність (фіксований барвник для життєздатності eFluor450, eBioscience) та проліферацію (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Оцініть ефекторну функцію, стимулюючи клітини PMA (20 нг/мл) та іономіцином (1 мкг/мл) за допомогою GolgiStop протягом 4 годин, та контролюйте CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) та TNFα-флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) (MAb11, BD). Стимулюйте клітини qPCR та ChIP за допомогою PMA (20 нг/мл) та іономіцину (1 мкг/мл) протягом 4 годин. Супернатант ELISA збирали до та після стимуляції PMA (20 нг/мл) та іономіцином (1 мкг/мл) протягом 4 годин.
Дотримуйтесь протоколу виробника для виділення РНК за допомогою набору RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Використовуйте QIAshredder (QIAGEN) для гомогенізації зразка. Використовуйте набір High-Capacity RNA to cDNA (Thermo Fisher Scientific) для синтезу комплементарної ДНК (кДНК). Використовуйте TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) для кількісної оцінки експресії генів (відповідно до протоколу виробника) з такими зондами: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [гліцеральдегід-3-фосфат водню (GAPDH)] та Hs01010726_m1 (SLC22A2). Зразки аналізували на системі ПЛР у реальному часі StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) у швидкому оптичному 96-лунковому реакційному планшеті MicroAmp (Applied Biosystems) з оптичною плівкою MicroAmp. Будь-яке значення Ct, що перевищує 35, вважається таким, що перевищує поріг виявлення, і позначається як невиявлюване.
Виконайте ChIP, як описано раніше (58). Коротко кажучи, клітини обробляли формальдегідом (кінцева концентрація 1,42%) та інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Використовуйте доповнений буфер для набухання (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl та 0,1% NP-40) на льоду протягом 10 хвилин, потім ресуспендуйте в буфері для імунопреципітації, як описано (58). Потім зразок обробляли ультразвуком з наступними циклами: 10 циклів (20 1-секундних імпульсів) та статичний час 40 секунд. Інкубуйте імуноглобулін G класу ChIP (Cell Signaling Technology; 1 мкл), гістон H3 (Cell Signaling Technology; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) та антитіла SP1 (Cell Signaling Technology; 3 мкл) зі зразком при 4°C, струшуйте протягом ночі. Інкубуйте кульки білка А (Thermo Fisher Scientific) зі зразком при 4°C з легким струшуванням протягом 1 години, потім використовуйте кульки chelex (Bio-Rad) для збагачення ДНК та протеїназу K (Thermo Fisher) для перетравлення білка. Промотор TNFα виявляли за допомогою ПЛР: прямого напрямку, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; навпаки, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (продукт 207 п.н.). Зображення були отримані за допомогою Image Lab (Bio-Rad) та кількісно визначені за допомогою програмного забезпечення ImageJ.
Супернатант клітинної культури збирали, як описано вище. Визначення проводили згідно з процедурами виробника наборів для визначення TNFα (Invitrogen), IL-2 (Invitrogen) та IFN-γ (Abcam). Згідно з протоколом виробника, супернатант розводили у співвідношенні 1:100 для виявлення TNFα та IL-2, та 1:3 для виявлення IFN-γ. Для вимірювання поглинання при 450 нм використовували багатомітковий рідер EnVision 2104 (PerkinElmer).
PBMC відокремлювали від продуктів розділення лейкоцитів (STEMCELL Technologies) за допомогою градієнтного центрифугування Ficoll у градієнті щільності. CD3+ клітини виділяли з PBMC за допомогою CD3-кульок (Miltenyi). У присутності або відсутності MNA, CD3+ клітини активували зв'язаним з пластиною CD3 (5 мкг/мл), розчинним CD28 (3 мкг/мл) та IL-2 (300 Од/мл; Proleukin) протягом 3 днів. Через 3 дні клітини збирали та промивали 0,9% фізіологічним розчином, а осад швидко заморожували. Підрахунок клітин проводили за допомогою проточної цитометрії (Cytek Aurora; конфігурація 3L-16V-14B-8R) з використанням 123count eBeads.
Метаболіти екстрагують, як описано вище. Висушений екстракт відновлюють у концентрації 4000 клітинних еквівалентів/мкл. Проаналізують зразок за допомогою обернено-фазової хроматографії (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія) та колонки CORTECS T3 (2,1×150 мм, розмір частинок 1,6 мкм, розмір пор 120 Å; #186008500, Waters). Полярний мас-спектрометр (6470, Agilent), в якому іонізація електророзпиленням працює в позитивному режимі. Рухома фаза А - 0,1% мурашина кислота (у H2O), рухома фаза B - 90% ацетонітрил, 0,1% мурашина кислота. Градієнт РХ становить від 0 до 2 хвилин для 100% А, від 2 до 7,1 хвилини для 99% В та від 7,1 до 8 хвилин для 99% В. Потім повторно зрівноважте колонку рухомою фазою А зі швидкістю потоку 0,6 мл/хв протягом 3 хвилин. Швидкість потоку становить 0,4 мл/хв, а камеру колонки нагрівають до 50°C. Використовують чистий хімічний стандарт MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Норт-Йорк, Онтаріо, Канада) для встановлення часу утримування (RT) та перетворення (RT = 0,882 хвилини, перетворення 1 = 137→94,1, перетворення 2 = 137→92, перетворення 3 = 137→78). Коли всі три переходи відбуваються з правильним часом утримування, перехід 1 використовується для кількісного визначення, щоб забезпечити специфічність. Стандартну криву MNA (Toronto Research Chemical Company) було побудовано шляхом шести серійних розведень вихідного розчину (1 мг/мл) для отримання стандартів рідини з концентрацією 0,1, 1,0, 10 та 100 нг/мл та 1,0 та 10 мкг/мл відповідно. Межа виявлення становить 1 нг/мл, а лінійна реакція знаходиться в діапазоні від 10 нг/мл до 10 мкг/мл. Кожна ін'єкція двох мікролітрів зразка та стандарту використовується для аналізу LC/MS, а змішаний зразок контролю якості проводиться кожні вісім ін'єкцій для забезпечення стабільності аналітичної платформи. Реакції MNA всіх зразків клітин, оброблених MNA, знаходилися в межах лінійного діапазону аналізу. Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення для кількісного аналізу MassHunter (версія 9.0, Agilent).
Конструкцію αFR-CAR другого покоління було взято з Song et al. (59). Коротко кажучи, конструкція містить наступний вміст: лідерну послідовність CD8a, специфічний для αFR людський одноланцюговий варіабельний фрагмент, шарнірну та трансмембранну області CD8a, внутрішньоклітинний домен CD27 та внутрішньоклітинний домен CD3z. Повну послідовність CAR було синтезовано за допомогою GenScript, а потім клоновано у вектор експресії лентивірусу другого покоління вище за течією від касети експресії GFP, яка використовується для оцінки ефективності трансдукції.
Лентивірус отримують шляхом трансфекції клітин HEK293T [Американська колекція типових культур (ATCC); вирощують у модифікованому середовищі Ігла Дульбекко, що містить 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) та 1% PenStrep, та використовують вектор CAR-GFP та Пакувальні плазміди (psPAX2 та pMD2.G, Addgene) використовують ліпофекційний амін (Sigma-Aldrich). Супернатант, що містить вірус, збирають через 48 та 72 години після трансфекції, фільтрують та концентрують ультрацентрифугуванням. Зберігають концентрований вірусний супернатант при температурі -80°C до трансдукції.
PBMC відокремлюють від продуктів розділення лейкоцитів здорових донорів (STEMCELL Technologies) за допомогою градієнтного центрифугування Ficoll у градієнтній щільності. Використовують мікрокульки CD8 позитивної селекції (Miltenyi) для виділення CD8+ клітин з PBMC. Стимулюють Т-клітини за допомогою TransAct (Miltenyi) та в середовищі TexMACS [Miltenyi; доповненому 3% інактивованою теплом людською сироваткою, 1% PenStrep та IL-2 (300 Од/мл)]. Через двадцять чотири години після стимуляції Т-клітини трансдукують лентивірусом (10 мкл концентрованого вірусного супернатанту на 106 клітин). Через 1-3 дні після трансдукції на Cytek Aurora (на FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) оцінюють експресію GFP клітин, щоб продемонструвати ефективність трансдукції щонайменше 30%.
CAR-T-клітини культивували протягом 24 годин у середовищі Immunocult (STEMCELL Technologies; з додаванням 1% PenStrep) за таких умов: необроблені, оброблені 250 мкМ аденозином або 10 мМ MNA. Після попередньої обробки CAR-T-клітини промивали PBS та об'єднували з 20 000 клітин SK-OV-3 [ATCC; у середовищі McCoy 5A (Sigma-Aldrich), з додаванням 10% FBS та 1% PenStrep при 10: Співвідношення ефектора до мішені, що дорівнювало 1, ампліфікували у трьох повторностях у середовищі Immunocult з додаванням. Клітини SK-OV-3 та клітини SK-OV-3, лізовані сапоніном наперстянки (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich), використовували як негативний та позитивний контролі відповідно. Після 24 годин спільного культивування супернатант збирали та вимірювали лактатдегідрогеназу (LDH) згідно з інструкціями виробника (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Супернатант LDH розводили у співвідношенні 1:50 у буфері LDH. Відсоток знищення вимірювали за такою формулою: відсоток знищення = відсоток корекції / максимальний рівень знищення x 100%, де відсоток корекції = лише спільне культивування Т-клітин, а максимальний рівень знищення = позитивний контроль - негативний контроль.
Як описано в тексті або матеріалах і методах, для статистичного аналізу використовуйте GraphPad Prism 8, Microsoft Excel або R версії 3.6.0. Якщо від одного пацієнта зібрано кілька зразків (наприклад, асцит та пухлина), ми використовуємо парний t-тест або включаємо пацієнта як випадковий ефект у лінійну або узагальнену модель, залежно від обставин. Для метаболомного аналізу тест на важливість виконується у трьох повторностях.
Додаткові матеріали до цієї статті див. за посиланням http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Це стаття з відкритим доступом, що розповсюджується відповідно до умов ліцензії Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, яка дозволяє використання, розповсюдження та відтворення на будь-якому носії, за умови, що кінцеве використання не має комерційної вигоди, і передумова полягає в тому, що оригінальна робота є правильною. Посилання.
Примітка: Ми просимо вас надати свою адресу електронної пошти лише для того, щоб людина, яку ви рекомендуєте для сторінки, знала, що ви хочете, щоб вона побачила цей лист, і що це не спам. Ми не збиратимемо жодних адрес електронної пошти.
Це питання використовується для перевірки, чи ви відвідувач, та запобігання автоматичному надсиланню спаму.
Маріса К. Кілгур (Marisa K. Kilgour), Сара Макферсон (Sarah MacPherson), Лорен Г. Захаріас (Lauren G. Zacharias), Ебігейл Елі Аріс Г. Уотсон (H. Watson), Джон Стегг (John Stagg), Бред Х. Нельсон (Brad H. Nelson), Ральф Дж. Де Беллардіні (Ralph J. ДеБерардініс), Рассел Дж. Джонс (Russell G. Jones), Фінеас Т. Гамільтон (Phineas T.
МНА сприяє імуносупресії Т-клітин і є потенційною мішенню імунотерапії для лікування раку людини.
Маріса К. Кілгур (Marisa K. Kilgour), Сара Макферсон (Sarah MacPherson), Лорен Г. Захаріас (Lauren G. Zacharias), Ебігейл Елі Аріс Г. Уотсон (H. Watson), Джон Стегг (John Stagg), Бред Х. Нельсон (Brad H. Nelson), Ральф Дж. Де Беллардіні (Ralph J. ДеБерардініс), Рассел Дж. Джонс (Russell G. Jones), Фінеас Т. Гамільтон (Phineas T.
МНА сприяє імуносупресії Т-клітин і є потенційною мішенню імунотерапії для лікування раку людини.
©2021 Американська асоціація сприяння розвитку науки. всі права захищені. AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.